ในปี 603 สมเด็จพระสันตะปาปาเกรกอรีที่ 1 ทรงมอบหมายให้ Ravennate Abbot Probus ซึ่งเคยเป็นทูตของเกรกอรีที่ราชสำนักลอมบาร์ด ให้สร้างโรงพยาบาลในกรุงเยรูซาเลมเพื่อรักษาและดูแลผู้แสวงบุญ ที่เป็นคริสเตียน ไปยังดินแดนศักดิ์สิทธิ์ ในปี 800 จักรพรรดิชาร์ลมาญได้ขยายโรงพยาบาลของ Probus และเพิ่มห้องสมุดเข้าไป ประมาณ 200 ปีต่อมา ในปี 1009 คอลีฟะฮ์ฟา ติมียะห์ อัล-ฮาคิม บิอัมร์ อัลลอฮฺ ทำลายโรงพยาบาลและอาคารอื่นๆ อีกสามพันแห่งในกรุงเยรูซาเล็ม ในปี 1023 พ่อค้าจากอามาลฟีและซาแลร์โนในอิตาลีได้รับอนุญาตจากกาหลิบ อาลี อัซ-ซาฮีร์ ให้สร้างโรงพยาบาลขึ้นใหม่ในกรุงเยรูซาเล็ม โรงพยาบาลแห่งนี้ได้รับการดูแลโดยคณะนักบุญเบเนดิกต์ ซึ่งสร้างขึ้นบนพื้นที่ของอารามนักบุญยอห์นเดอะแบปติสต์ และรับผู้แสวงบุญชาวคริสต์เดินทางไปเยี่ยมชมสถานที่ศักดิ์สิทธิ์ของชาวคริสต์

ดังนั้นเชื่อกันว่าโรงพยาบาลเซนต์จอห์นก่อตั้งขึ้นไม่นานก่อนปี ค.ศ. 1070 ในกรุงเยรูซาเลม โดยเป็นที่พึ่งของสำนักเบเนดิกตินแห่งโบสถ์เซนต์แมรีแห่งลาตินส์ พ่อค้าชาวอามาลเฟียผู้ก่อตั้งได้อุทิศบ้านพักรับรองนี้ให้กับนักบุญยอห์นผู้ให้บัพติศมา ซึ่งสะท้อนให้เห็นถึงมหาวิหารไม้กางเขนก่อนศตวรรษที่ 6 ในเมืองอามาลฟีซึ่งอุทิศให้กับอัสสัมชัญ หลังจากนั้นไม่นาน ได้มีการก่อตั้งบ้านพักรับรองสตรีแห่งที่สองขึ้นและอุทิศให้กับนักบุญมารีย์แม็กดาเลน โรงพยาบาลในเขตมูริสตันของกรุงเยรูซาเลมมีไว้เพื่อดูแลผู้แสวงบุญที่ป่วย คนยากจน หรือได้รับบาดเจ็บไปยังดินแดนศักดิ์สิทธิ์

คำสั่งของโรงพยาบาลสงฆ์ถูกสร้างขึ้นหลังจาก สงครามครูเสดครั้งแรก โดยบุญราศีเจอราร์ด เดอ มาร์ตีกส์ ซึ่งบทบาทในฐานะผู้ก่อตั้งได้รับการยืนยันโดยพระสันตะปาปา Pie postulatio voluntatis ที่ออกโดยสมเด็จพระสันตะปาปาปาสชาลที่ 2 ในปี 1113 เจอราร์ดได้รับอาณาเขตและรายได้สำหรับคำสั่งของเขาทั่ว ราชอาณาจักรเยรูซาเลม และ เกิน. ภายใต้ผู้สืบทอดของเขา Raymond du Puy บ้านพักรับรองเดิมได้ขยายไปยังห้องพยาบาลใกล้กับโบสถ์ Holy Sepulchre ในกรุงเยรูซาเล็ม ในตอนแรก กลุ่มนี้ดูแลผู้แสวงบุญในกรุงเยรูซาเลม แต่ในไม่ช้า คำสั่งดังกล่าวได้ขยายออกไปเพื่อจัดหาอุปกรณ์ติดอาวุธคุ้มกันแก่ผู้แสวงบุญ ก่อนที่จะกลายเป็นกำลังทหารที่สำคัญในที่สุด ด้วยเหตุนี้คณะนักบุญยอห์นจึงกลายเป็นทหารโดยไม่สูญเสียคุณลักษณะด้านการกุศลจนแทบมองไม่เห็น

Raymond du Puy ซึ่งรับช่วงต่อจากเจอราร์ดในฐานะหัวหน้าของโรงพยาบาลในปี 1118 ได้จัดตั้งกองทหารอาสาจากสมาชิกของคณะ โดยแบ่งกองบัญชาการออกเป็นสามระดับ ได้แก่ อัศวิน ทหารและภาคทัณฑ์ เรย์มอนด์เสนอบริการกองกำลังติดอาวุธของเขาแก่บอลด์วินที่ 2 แห่งเยรูซาเลม และคำสั่งต่อจากนี้เข้าร่วมในสงครามครูเสดในฐานะคำสั่งทางทหาร โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการสร้างความแตกต่างในการปิดล้อมแอสคาลอนในปี 1153

หลังจากความสำเร็จของ สงครามครูเสดครั้งแรก ในการยึดกรุงเยรูซาเลมในปี ค.ศ. 1099 พวกครูเสดจำนวนมากได้บริจาคทรัพย์สินใหม่ของตนในลิแวนต์ให้กับโรงพยาบาลเซนต์จอห์น การบริจาคในช่วงแรกอยู่ในอาณาจักรเยรูซาเลมที่เพิ่งจัดตั้งขึ้นใหม่ แต่เมื่อเวลาผ่านไป คำสั่งดังกล่าวได้ขยายการถือครองไปยัง รัฐครูเสด ในเทศมณฑลตริโปลีและราชรัฐอันติโอก หลักฐานแสดงให้เห็นว่าในช่วงทศวรรษที่ 1130 คำสั่งดังกล่าวเริ่มมีกำลังทหารเมื่อฟุลค์ กษัตริย์แห่งเยรูซาเลม พระราชทานปราสาทที่สร้างขึ้นใหม่ที่เบธ กิเบอลินตามคำสั่งในปี 1136 วัวของสันตะปาปาระหว่างปี 1139 ถึง 1143 อาจบ่งบอกถึงคำสั่งจ้างคนเพื่อปกป้องผู้แสวงบุญ นอกจากนี้ยังมีคำสั่งทางทหารอื่นๆ เช่น อัศวินเทมพลาร์ ที่ให้ความคุ้มครองผู้แสวงบุญ

ระหว่างปี 1142 ถึง 1144 เรย์มอนด์ที่ 2 เคานต์แห่งตริโปลี ได้รับทรัพย์สินในเทศมณฑลตามคำสั่ง ตามคำกล่าวของนักประวัติศาสตร์ โจนาธาน ไรลีย์-สมิธ พวกฮอสปิทัลเลอร์ได้ก่อตั้ง "เพดานปาก" ภายในตริโปลีได้อย่างมีประสิทธิภาพ ทรัพย์สินรวมถึงปราสาทซึ่งคาดหวังให้ Hospitallers ปกป้อง ตริโปลี พร้อมด้วย Krak des Chevaliers เหล่า Hospitallers ยังได้รับปราสาทอีก 4 แห่งตามแนวชายแดนของรัฐ ซึ่งได้รับอนุญาตให้มีคำสั่งให้ครองพื้นที่ได้ ข้อตกลงของคำสั่งกับ Raymond II ระบุว่าหากเขาไม่ได้ติดตามอัศวินของภาคีในการรณรงค์ ของที่ริบจะเป็นของคำสั่งทั้งหมด และหากเขาอยู่ที่นั่น จะถูกแบ่งเท่า ๆ กันระหว่างการนับและคำสั่ง นอกจากนี้ พระเจ้าเรย์มอนด์ที่ 2 ไม่สามารถสร้างสันติภาพกับชาวมุสลิมได้หากไม่ได้รับอนุญาตจาก Hospitallers เหล่าฮอสปิทัลเลอร์ได้ทำให้ Krak des Chevaliers เป็นศูนย์กลางการบริหารสำหรับทรัพย์สินใหม่ของพวกเขา โดยดำเนินงานที่ปราสาทซึ่งจะทำให้ปราสาทแห่งนี้เป็นป้อมปราการของผู้ทำสงครามครูเสดที่ซับซ้อนที่สุดแห่งหนึ่งในลิแวนต์

เมื่อ สงครามครูเสดครั้งที่สอง เริ่มขึ้นในปี 1147 พวกฮอสปิทัลเลอร์ถือเป็นกำลังสำคัญในราชอาณาจักร และความสำคัญทางการเมืองของประมุขก็เพิ่มมากขึ้น ในเดือนมิถุนายน ค.ศ. 1148 ที่สภาเอเคอร์ เรย์มงด์ ดู ปุยเป็นหนึ่งในเจ้าชายที่รับหน้าที่ตัดสินใจเข้าล้อมดามัสกัส การตำหนิสำหรับการสูญเสียอันหายนะนั้นตกเป็นหน้าที่ของ เทมพลาร์ ไม่ใช่ฝ่ายฮอสปิทัลเลอร์ ในดินแดนศักดิ์สิทธิ์ อิทธิพลของ Hospitallers มีอิทธิพลเหนือกว่าโดยมีบทบาทชี้ขาดในการปฏิบัติการทางทหารอันเนื่องมาจากการปกครองของ Raymond

การปกครองของโจแบต์สิ้นสุดลงด้วยการสวรรคตของเขาในปี ค.ศ. 1177 และโรเจอร์ เดอ มูแลงส์ เป็นผู้สืบทอดตำแหน่งปรมาจารย์ ในเวลานั้น Hospitallers ได้ก่อตั้งองค์กรทหารที่แข็งแกร่งที่สุดแห่งหนึ่งของราชอาณาจักร โดยแยกออกจากภารกิจต้นกำเนิดของ Order การกระทำประการแรกๆ ของโรเจอร์คือเรียกร้องให้บอลด์วินที่ 4 แห่งเยรูซาเลมดำเนินคดีอย่างแข็งขันต่อสงครามกับศอลาฮุดดีนต่อไป และในเดือนพฤศจิกายน ค.ศ. 1177 เขาได้เข้าร่วมในยุทธการที่มงต์จิซาร์ด โดยได้รับชัยชนะเหนืออัยยูบิด สมเด็จพระสันตะปาปาอเล็กซานเดอร์ที่ 3 เรียกพวกเขาให้กลับไปสู่การปฏิบัติตามการปกครองของเรย์มงด์ ดู ปุยระหว่างปี 1178 ถึง 1180 โดยออกวัวที่ห้ามไม่ให้พวกเขาจับอาวุธเว้นแต่พวกเขาจะถูกโจมตีและกระตุ้นให้พวกเขาไม่ละทิ้งการดูแลผู้ป่วยและความยากจน อเล็กซานเดอร์ที่ 3 ชักชวนโรเจอร์ให้สงบศึกในปี 1179 กับเทมพลาร์โอโด เดอ แซงต์อามานด์ ซึ่งในขณะนั้นคือปรมาจารย์ผู้เป็นทหารผ่านศึกแห่งมงต์กิซาร์เช่นกัน

ในปี 1186 Bertrand Mazoir ขาย Margat ให้กับ Hospitallers เนื่องจากมีราคาแพงเกินกว่าที่ตระกูล Mazoir จะดูแลรักษาได้ หลังจากการสร้างและขยายใหม่โดย Hospitallers มันก็กลายเป็นสำนักงานใหญ่ในซีเรีย ภายใต้การควบคุมของฮอสปิทอลเลอร์ หอคอยทั้ง 14 แห่งของมันถูกคิดว่าไม่สามารถต้านทานได้

ป้อมปราการ คริสเตียน ที่สำคัญหลายแห่งในดินแดนศักดิ์สิทธิ์ถูกสร้างขึ้นโดย เทมพลาร์ และฮอสปิทัลเลอร์ ในช่วงที่อาณาจักรเยรูซาเลมรุ่งเรืองที่สุด พวกฮอสปิทัลเลอร์มีป้อมใหญ่เจ็ดป้อมและที่ดินอื่นๆ อีก 140 แห่งในบริเวณนั้น ทรัพย์สินของออร์เดอร์ถูกแบ่งออกเป็นไพรเอียรี แบ่งออกเป็นไบลิวิค ซึ่งในทางกลับกันก็แบ่งออกเป็นผู้บัญชาการ

ยุทธการที่ฮัตตินในปี 1187 ถือเป็นความพ่ายแพ้อันหายนะสำหรับพวกครูเสด: กายแห่งลูซินญัน กษัตริย์แห่งเยรูซาเลม ถูกจับ เช่นเดียวกับทรูครอส ซึ่งเป็นโบราณวัตถุที่ค้นพบระหว่าง สงครามครูเสดครั้งแรก หลังจากนั้น ซาลาดินได้สั่งประหารอัศวิน เทมพลาร์ และอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ที่ถูกจับ นั่นคือความสำคัญของคำสั่งทั้งสองในการปกป้องรัฐครูเสด หลังจากการสู้รบ ปราสาท Hospitaller ของ Belmont, Belvoir และ Bethgibelin ตกเป็นของกองทัพมุสลิม หลังจากการสูญเสียเหล่านี้ ออร์เดอร์มุ่งความสนใจไปที่ปราสาทในตริโปลี ในเดือนพฤษภาคม ค.ศ. 1188 ศอลาฮุดดีนนำทัพเข้าโจมตีคราก เด เชอวาลิเยร์ แต่เมื่อเห็นปราสาทก็ตัดสินใจว่ามีการป้องกันที่ดีเกินไป และกลับเดินทัพไปที่ปราสาทฮอสปิทัลเลอร์แห่งมาร์กัต ซึ่งเขาล้มเหลวในการยึดเช่นกัน

ในช่วงปลายปี ค.ศ. 1189 Armengol de Aspa สละราชสมบัติและไม่มีการเลือกปรมาจารย์คนใหม่จนกว่า Garnier of Nablus จะได้รับเลือกในปี 1190 Garnier ได้รับบาดเจ็บสาหัสที่ Hattin ในปี 1187 แต่ก็สามารถไปถึง Ascalon และหายจากบาดแผลได้ ในช่วงเวลานั้นเขาอยู่ในปารีสเพื่อรอพระเจ้าริชาร์ดที่ 1 แห่งอังกฤษออกเดินทางใน สงครามครูเสดครั้งที่สาม เขามาถึงเมสซีนาในวันที่ 23 กันยายน ซึ่งเขาได้พบกับฟิลิปป์ ออกุสต์ และโรแบร์ที่ 4 เดอ ซาเบล ซึ่งในไม่ช้าจะได้เป็นประมุขแห่ง เทมพลาร์

การ์นีเยร์ออกจากเมสซีนาในวันที่ 10 เมษายน ค.ศ. 1191 พร้อมกับกองเรือของริชาร์ด ซึ่งต่อจากนั้นจอดทอดสมอที่ท่าเรือเลเมซอสในวันที่ 1 พฤษภาคม ริชาร์ดปราบเกาะได้ในวันที่ 11 พฤษภาคม แม้ว่าการ์นีเยร์จะไกล่เกลี่ยก็ตาม พวกเขาออกเดินทางอีกครั้งในวันที่ 5 มิถุนายน และมาถึงเอเคอร์ภายใต้การควบคุม ของอัยยูบิด ตั้งแต่ปี 1187 ที่นั่นพวกเขาพบว่าฟิลิปป์ ออกุสต์เป็นผู้นำการปิดล้อมเอเคอร์ ซึ่งเป็นความพยายามนานสองปีในการขับไล่ชาวมุสลิม ในที่สุดผู้ปิดล้อมก็ได้รับความเหนือกว่า และภายใต้สายตาที่สิ้นหวังของศอลาฮุดดีน ผู้พิทักษ์มุสลิมก็ยอมจำนนในวันที่ 12 กรกฎาคม พ.ศ. 1191

วันที่ 22 สิงหาคม ค.ศ. 1191 ริชาร์ดเสด็จลงใต้ไปยังอาร์ซุฟ พวกเทมพลาร์เป็นกองหน้าและมีฮอสปิทัลเลอร์เป็นกองหลัง ริชาร์ดเดินทางไปพร้อมกับกองกำลังชั้นยอดที่พร้อมจะเข้าแทรกแซงเมื่อจำเป็น Hospitallers ถูกโจมตีเมื่อวันที่ 7 กันยายน ซึ่งเป็นจุดเริ่มต้นของยุทธการที่ Arsuf อัศวินของการ์เนียร์ซึ่งตั้งอยู่ที่ด้านหลังของเสาทหารอยู่ภายใต้แรงกดดันอย่างหนักจากชาวมุสลิม และเขาขี่ม้าไปข้างหน้าเพื่อชักชวนริชาร์ดให้โจมตี ซึ่งเขาปฏิเสธ ในที่สุด การ์เนียร์และอัศวินอีกคนหนึ่งก็พุ่งไปข้างหน้า และไม่นานก็เข้าร่วมกับกองกำลัง Hospitaller ที่เหลือ ริชาร์ด แม้ว่าคำสั่งของเขาจะไม่เชื่อฟัง แต่ก็ส่งสัญญาณให้ตั้งข้อหาเต็มจำนวน สิ่งนี้จับศัตรูได้ในช่วงเวลาที่อ่อนแอ และอันดับของพวกมันก็แตกสลาย การ์นีเยร์จึงมีส่วนสำคัญในการชนะการรบ แม้ว่าจะฝ่าฝืนคำสั่งของริชาร์ดก็ตาม

Guérin de Montaigu ได้รับเลือกเป็นปรมาจารย์ในฤดูร้อนปี 1207 เขาได้รับการขนานนามว่าเป็น "บุคคลหนึ่งของปรมาจารย์ที่ยิ่งใหญ่ที่สุดคนหนึ่งที่โรงพยาบาลมีเหตุผลที่น่าภาคภูมิใจ" เชื่อกันว่าเขาเป็นน้องชายของปิแอร์ เดอ มอนไตกู ซึ่งทำหน้าที่เป็น ปรมาจารย์เทมพลาร์ ตั้งแต่ปี 1218 ถึง 1232 เช่นเดียวกับผู้ดำรงตำแหน่งสองคนก่อน Montaigu พบว่าตัวเองเข้าไปพัวพันกับกิจการของแอนติออคในสงครามสืบราชบัลลังก์แอนติโอเชน โดยเริ่มด้วยการเปิดฉาก พินัยกรรมของโบเฮมงด์ที่ 3 แห่งอันทิโอก พินัยกรรมได้สั่งให้หลานชายของเขา Raymond-Roupen เป็นผู้สืบทอด Bohémond IV แห่ง Antioch บุตรชายคนที่สองของ Bohémond III และ Count of Tripoli ไม่ยอมรับพินัยกรรมนี้ ลีโอที่ 1 แห่งอาร์เมเนียในฐานะคุณลุงของมารดา เข้าข้างเรย์มงด์-รูเปน อย่างไรก็ตาม โดยไม่ต้องรอให้บิดาของเขาเสียชีวิต Bohémond IV ก็เข้าครอบครองอาณาเขต เหล่าเทมพลาร์ได้ปรับตัวเข้ากับชนชั้นกระฎุมพีแห่งอันติออคและอัซ-ซาฮีร์ กาซี สุลต่านอัยยูบิดแห่งอเลปโป ในขณะที่พวกฮอสปิทัลเลอร์เข้าข้างเรย์มอนด์-รูเปนและ กษัตริย์แห่งอาร์เมเนีย

เมื่อเดอ มอนไตกูเข้ารับตำแหน่งฮอสปิทัลเลอร์ ไม่มีอะไรเปลี่ยนแปลง ลีโอที่ 1 แห่งอาร์เมเนียได้สถาปนาตนเองเป็นเจ้าเมืองอันติออคและตั้งหลานชายของเขาขึ้นใหม่ที่นั่น แต่มันเป็นช่วงเวลาสั้น ๆ และเนื่องจากเคานต์แห่งตริโปลียังคงเป็นเจ้าเมือง ลีโอที่ 1 สนับสนุนคำกล่าวอ้างของเขาโดยการริบทรัพย์สินของเทมพลาร์ในซิลีเซีย ทำลายการค้าขายของอันทิโอกโดยการบุก และถึงขั้นเสี่ยงต่อการคว่ำบาตรในปี 1210–1213 มีการบรรลุข้อตกลงระหว่างกษัตริย์กับเทมพลาร์ และการคว่ำบาตรก็ถูกเพิกถอน ในวันที่ 14 กุมภาพันธ์ ค.ศ. 1216 อันทิโอกถูกมอบไว้ในพระหัตถ์ของลีโอที่ 1 และเรย์มงด์-รูเปนหลานชายของเขา ขุนนาง Antiochene อนุญาตให้ Bohémond IV กลับมาและการหลบหนีของ Raymon-Roupen ซึ่งต่อมาเสียชีวิตในปี 1222

Bohémond IV เรียกร้องให้แก้แค้น Hospitallers โดยยึดปราสาท Antioch กลับคืนมาจากพวกเขา และทรัพย์สินใน Tripoli ของพวกเขาก็ถูกทำลายลง Honorius III ร้องขอต่อพวกเขาในปี 1225 และ 1226 และผู้สืบทอดของเขา Gregory IX คว่ำบาตร Bohémond IV ในปี 1230 พระองค์ทรงมอบอำนาจให้เจอราลด์แห่งโลซาน พระสังฆราชละตินแห่งเยรูซาเลม ยกเลิกการสั่งห้ามหากโบเฮมอนด์ตกลงที่จะสร้างสันติภาพกับฮอสปิทัลเลอร์ ด้วยการไกล่เกลี่ยระหว่างเจอรัลด์และตระกูลอิเบลิน โบเฮมอนด์และฮอสปิทัลเลอร์จึงตกลงในสนธิสัญญาซึ่งลงนามเมื่อวันที่ 26 ตุลาคม ค.ศ. 1231 โบเฮมอนด์ยืนยันสิทธิ์ของฮอสปิทัลเลอร์ในการยึดจาบาลาและป้อมปราการใกล้เคียง และมอบเงินศักดินาให้พวกเขาทั้งในตริโปลีและอันติออค เหล่า Hospitaller ละทิ้งเอกสิทธิ์ที่ Raymond-Roupen มอบให้พวกเขา ไม่นานนัก เจอรัลด์แห่งโลซานก็ยกเลิกการคว่ำบาตรและส่งสนธิสัญญาไปยังโรมเพื่อให้สันตะสำนักยืนยัน

ในปี 1244 ชาว Ayyubid อนุญาตให้ชาว Khwarazmians ซึ่งอาณาจักรของพวกเขาถูกทำลายโดย ชาวมองโกล ในปี 1231 ให้โจมตีเมือง เหล่า เทมพลาร์ เริ่มเสริมกำลังเมืองเยรูซาเลมในปี 1244 เมื่อการรุกรานของ Khwarezmian เกิดขึ้น กองกำลังที่ถูกเรียกโดย as-Salih Ayyub สุลต่านแห่งอียิปต์ พวกเขายึดทิเบเรียส ซาเฟด และตริโปลี และเริ่มการปิดล้อมกรุงเยรูซาเลมในวันที่ 15 กรกฎาคม ค.ศ. 1244 เนื่องจากข้อตกลงระหว่างเฟรดเดอริกที่ 2 และอัล-คามิล กำแพงจึงมีการป้องกันไม่เพียงพอและไม่สามารถทนต่อการโจมตีได้ พระสังฆราชแห่งเยรูซาเลม โรเบิร์ตแห่งน็องต์ และผู้นำของเทมพลาร์และฮอสปิทัลเลอร์มาเพื่อสนับสนุนชาวเมืองและขับไล่ผู้โจมตีในตอนแรก จักรพรรดิคาสเทลลันและผู้บัญชาการใหญ่ของโรงพยาบาลเสียชีวิตในการสู้รบ แต่ไม่ได้รับความช่วยเหลือจากแฟรงค์เลย

เมืองล่มสลายอย่างรวดเร็ว Khwarazmians ปล้นย่านอาร์เมเนียซึ่งพวกเขาทำลายล้างประชากร คริสเตียน และขับไล่ชาวยิวออกไป นอกจากนี้ พวกเขาได้ไล่ออกจากสุสานของกษัตริย์แห่งเยรูซาเลมในโบสถ์แห่งสุสานศักดิ์สิทธิ์ และขุดกระดูกของพวกเขาออกมา ซึ่งสุสานของบอลด์วินที่ 1 และก็อดฟรีย์แห่งบูยงกลายเป็นอนุสรณ์สถาน เมื่อวันที่ 23 สิงหาคม หอคอยแห่งเดวิดยอมจำนนต่อกองกำลังควาราซเมียน ชาย หญิง และเด็กที่เป็นคริสเตียนประมาณ 6,000 คนได้เดินขบวนออกจากกรุงเยรูซาเลม อัศวินฮอสปิทัลเลอร์และเทมพลาร์ได้ย้ายสำนักงานใหญ่ไปที่เมืองเอเคอร์

หลังจากการล่มสลายของกรุงเยรูซาเลม กองกำลังผสมได้รวมตัวกัน ซึ่งประกอบด้วย เทมพลาร์ อัศวินโรงพยาบาล และ อัศวินเต็มตัว เข้าร่วมกองทัพมุสลิมซึ่งประกอบด้วยชาวซีเรียและชาวทรานส์จอร์แดนภายใต้การนำของอัล-มันซูร์ อิบราฮิม และอัน-นาซีร์ ดาอูด กองทัพนี้อยู่ภายใต้การบังคับบัญชาของ Walter IV แห่ง Brienne และออกจาก Acre ซึ่งปัจจุบันเป็นที่ตั้งสำนักงานใหญ่ของ Order และออกเดินทางในวันที่ 4 ตุลาคม ค.ศ. 1244 กองทัพเหล่านี้ล้มลงบน Khwarezmians และกองทหารอียิปต์ ซึ่งได้รับคำสั่งจาก Baibars สุลต่านมัม ลุกแห่งอียิปต์ในอนาคต 17 ตุลาคม. ในสมรภูมิลาฟอร์บีใกล้ฉนวนกาซา พันธมิตรชาวมุสลิมของแฟรงค์หลุดออกไปในการเผชิญหน้าครั้งแรกกับศัตรู และชาวคริสต์พบว่าตัวเองอยู่ตามลำพัง การต่อสู้ที่ไม่เท่าเทียมกันสิ้นสุดลงด้วยภัยพิบัติ มีผู้เสียชีวิต 16,000 คน และ 800 คนถูกจับเข้าคุก ในจำนวนนี้มีอัศวิน 325 คน และทหาร turcopoliers 200 คนของ Hospitallers Guillaume de Chateauneuf เองก็ถูกจับและนำตัวไปยังกรุงไคโร มีเพียงเทมพลาร์ 18 คนและโรงพยาบาล 16 คนเท่านั้นที่สามารถหลบหนีได้ ผลชัยชนะของอัยยูบิดนำไปสู่การเรียกร้องให้มีสงครามครูเสดครั้งที่ 7 และถือเป็นการล่มสลายของอำนาจของชาวคริสต์ในดินแดนศักดิ์สิทธิ์

ในปี 1248 สมเด็จพระสันตะปาปาอินโนเซนต์ที่ 4 ทรงอนุมัติชุดทหารมาตรฐานสำหรับให้สวมใส่ระหว่างการสู้รบ แทนที่จะสวมเสื้อคลุมปิดทับชุดเกราะ (ซึ่งจำกัดการเคลื่อนไหว) พวกเขาสวมเสื้อคลุมสีแดงที่มีไม้กางเขนสีขาวประดับอยู่

วันที่ 3 มีนาคม ค.ศ. 1271 กองทัพของสุลต่านไบบาร์สจากมัม ลุกมาถึงครักเดเชอวาลิเยร์ เมื่อสุลต่านมาถึง ปราสาทอาจถูกกองกำลังมัมลุกปิดล้อมไว้เป็นเวลาหลายวัน มีเรื่องราวภาษาอาหรับสามเรื่องเกี่ยวกับการปิดล้อม มีเพียงคนเดียวเท่านั้นที่เป็นของอิบนุ ชัดดัด เป็นคนร่วมสมัยแม้ว่าเขาจะไม่ได้อยู่ด้วยก็ตาม ชาวนาที่อาศัยอยู่ในพื้นที่ได้หนีไปยังปราสาทเพื่อความปลอดภัยและถูกกักขังไว้ที่แผนกด้านนอก ทันทีที่ Baibars มาถึง เขาก็เริ่มสร้าง Mangonels ซึ่งเป็นอาวุธปิดล้อมที่ทรงพลังซึ่งเขาจะใช้เปิดปราสาท ตามที่อิบัน Shaddad กล่าว สองวันต่อมาแนวป้องกันแนวแรกถูกยึดโดยผู้ปิดล้อม เขาอาจจะหมายถึงชานเมืองที่มีกำแพงล้อมรอบด้านนอกทางเข้าปราสาท

เรนขัดขวางการปิดล้อม แต่ในวันที่ 21 มีนาคม โครงสร้างรูปสามเหลี่ยมที่อยู่ทางใต้ของ Krak des Chevaliers ซึ่งอาจได้รับการปกป้องด้วยรั้วไม้ก็ถูกยึดได้ เมื่อวันที่ 29 มีนาคม หอคอยที่อยู่มุมตะวันตกเฉียงใต้ถูกทำลายและพังทลายลง กองทัพของ Baibars โจมตีผ่านช่องโหว่และเมื่อเข้าสู่วอร์ดด้านนอกซึ่งพวกเขาพบกับชาวนาที่ขอลี้ภัยในปราสาท

แม้ว่าวอร์ดชั้นนอกจะพังทลายลงแล้ว และในระหว่างนั้นทหารรักษาการณ์จำนวนหนึ่งก็ถูกสังหาร พวกครูเซเดอร์ก็ถอยกลับไปยังวอร์ดชั้นในที่น่าเกรงขามกว่า หลังจากสงบอยู่สิบวัน ผู้ปิดล้อมได้ส่งจดหมายไปยังกองทหารรักษาการณ์ ซึ่งคาดว่ามาจากปรมาจารย์แห่งอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ในตริโปลี ซึ่งอนุญาตให้พวกเขายอมจำนน แม้ว่าจดหมายดังกล่าวจะเป็นของปลอม แต่กองทหารก็ยอมจำนนและสุลต่านก็ไว้ชีวิตพวกเขา เจ้าของปราสาทคนใหม่ได้ดำเนินการซ่อมแซม โดยเน้นที่ส่วนด้านนอกเป็นหลัก โบสถ์ฮอสพิทอลเลอร์ถูกดัดแปลงเป็นมัสยิด และมีมิห์ราบ 2 อันถูกเพิ่มเข้าไปภายใน

การล้อมเอเคอร์ (เรียกอีกอย่างว่าการล่มสลายของเอเคอร์) เกิดขึ้นในปี 1291 และส่งผลให้พวก ครูเซเดอร์ สูญเสียการควบคุมเอเคอร์ให้กับมัมลุกส์ ถือเป็นการต่อสู้ที่สำคัญที่สุดครั้งหนึ่งในยุคนั้น แม้ว่าขบวนการสงครามครูเสดจะดำเนินต่อไปอีกหลายศตวรรษ แต่การยึดเมืองถือเป็นจุดสิ้นสุดของสงครามครูเสดต่อลิแวนต์ต่อไป เมื่อเอเคอร์ล่มสลาย พวกครูเซเดอร์ก็สูญเสียฐานที่มั่นหลักสุดท้ายในอาณาจักรครูเซเดอร์แห่งเยรูซาเลม พวกเขายังคงรักษาป้อมปราการไว้ที่เมืองทาร์ตัสทางตอนเหนือ (ปัจจุบันอยู่ทางตะวันตกเฉียงเหนือของซีเรีย) มีส่วนร่วมในการจู่โจมชายฝั่ง และพยายามบุกจากเกาะรูอาดเล็กๆ แต่เมื่อพวกเขาสูญเสียสิ่งนั้นไปเช่นกันในปี 1302 ในการบุกโจมตี Ruad พวกครูเสดไม่ได้ควบคุมส่วนใดส่วนหนึ่งของดินแดนศักดิ์สิทธิ์อีกต่อไป

หลังจากเอเคอร์ อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ได้ขอลี้ภัยในราชอาณาจักรไซปรัส

พวกฮอสปิทัลเลอร์ได้ย้ายไปอยู่ที่ราชอาณาจักรไซปรัสหลังจากการล่มสลายของเอเคอร์ ฌอง เดอ วิลลิเยร์เข้าลี้ภัยในลิมาสโซลที่ปราสาทโคลอสซี และจัดพิธีบททั่วไปของคณะเมื่อวันที่ 6 ตุลาคม ค.ศ. 1292 เขาต้องการทำให้ Hospitallers อยู่ในตำแหน่งที่จะพิชิตดินแดนศักดิ์สิทธิ์อีกครั้ง เขาได้เตรียมพร้อมสำหรับการป้องกันไซปรัสและการปกป้องอาร์เมเนีย ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ถูกคุกคามโดยมัมลุกส์ เดอ วียาเรต์พัวพันกับการเมืองของไซปรัส จึงวางแผนที่จะครอบครองอาณาเขตชั่วคราวใหม่ นั่นคือเกาะโรดส์ ซึ่งในขณะนั้นเป็นส่วนหนึ่งของจักรวรรดิไบแซนไทน์

หลังจากการสูญเสียเอเคอร์ ความสมดุลของอำนาจในดินแดนศักดิ์สิทธิ์ระหว่าง ชาวคริสต์ และมัมลุกส์ก็เห็นได้ชัดว่าเป็นฝ่ายสนับสนุนกลุ่มหลังซึ่งยังคงก้าวหน้าต่อไป อย่างไรก็ตาม ชาวคริสต์สามารถไว้วางใจ ชาวมองโกล แห่ง เปอร์เซีย ที่นำโดยมาห์มุด กาซาน ข่าน ซึ่งลัทธิขยายอำนาจได้ผลักดันให้พวกเขาโลภดินแดนมัมลุก กองทัพของเขาเข้ายึดเมืองอเลปโปและอยู่ที่นั่นพร้อมกับข้าราชบริพารเฮธัมที่ 2 แห่ง อาร์เมเนีย ซึ่งมีกองกำลังรวมถึง เทมพลาร์ และฮอสปิทัลเลอร์บางส่วน ซึ่งทุกคนมีส่วนร่วมในการรุกที่เหลือ ชาวมองโกลและพันธมิตรเอาชนะมัมลุกในยุทธการฮอมซินครั้งที่สาม ธันวาคม ค.ศ. 1299 ข่านส่งทูตไปยังนิโคเซียเพื่อสร้างพันธมิตร พระเจ้าเฮนรีที่ 2 แห่งไซปรัส เฮธัมที่ 2 และปรมาจารย์เทมพลาร์ ฌาค เดอ โมเลย์ ตัดสินใจให้เขาพาเขาไปเฝ้าสมเด็จพระสันตะปาปาเพื่อสนับสนุนแนวคิดเรื่องการเป็นพันธมิตร ซึ่งเริ่มมีผลในปี 1300

กษัตริย์แห่งไซปรัสส่งกองทัพไปยังอาร์เมเนียพร้อมด้วยอัศวิน 300 คนจากทั้งสองคำสั่งซึ่งนำโดยปรมาจารย์เป็นการส่วนตัว พวกเขาบุกโจมตีเกาะ Ruad ใกล้ชายฝั่งซีเรีย โดยมีเป้าหมายที่จะเปลี่ยนให้เป็นฐานปฏิบัติการในอนาคต จากนั้นพวกเขาก็เข้ายึดเมืองท่าทอร์โตซา ปล้นสะดมภูมิภาค จับชาวมุสลิมจำนวนมากและขายพวกเขาเป็นทาสในอาร์เมเนียในขณะที่รอการมาถึงของชาวมองโกล แต่สิ่งนี้นำไปสู่การล่มสลายของ Ruad ซึ่งเป็นการต่อสู้ครั้งสุดท้ายเพื่อดินแดนศักดิ์สิทธิ์

เมื่อพวกฮอสปิทัลเลอร์ถอยกลับไปยังไซปรัส เกาะนี้ถูกปกครองโดยกษัตริย์เฮนรีที่ 2 แห่งไซปรัสซึ่งมียศเป็นกษัตริย์แห่งเยรูซาเลม เขาไม่ค่อยพอใจที่องค์กรที่มีอำนาจพอ ๆ กับ Order สามารถแข่งขันกับเขาเพื่ออำนาจอธิปไตยของเกาะเล็ก ๆ ของเขาได้ และมีแนวโน้มว่าจะวาง Guillaume de Villaret ไว้บนเส้นทางเพื่อพิชิตเกาะโรดส์

ตามที่ Gérard de Monréal กล่าว ทันทีที่เขาได้รับเลือกให้เป็นปรมาจารย์ของอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ในปี 1305 Foulques de Villaret ได้วางแผนการพิชิตโรดส์ ซึ่งจะทำให้เขามีเสรีภาพในการดำเนินการซึ่งเขาไม่สามารถมีได้ตราบใดที่คำสั่งยังคงอยู่ บนไซปรัส และจะเป็นฐานใหม่ในการทำสงครามกับพวกเติร์ก

โรดส์เป็นเป้าหมายที่น่าสนใจ นั่นคือเกาะที่อุดมสมบูรณ์ โดยตั้งอยู่ทางยุทธศาสตร์นอกชายฝั่งตะวันตกเฉียงใต้ของเอเชียไมเนอร์ คร่อมเส้นทางการค้าไปยังกรุงคอนสแตนติโนเปิลหรืออเล็กซานเดรียและลิแวนต์ เกาะนี้เป็นสมบัติของไบแซนไทน์ แต่จักรวรรดิที่อ่อนแอมากขึ้นเรื่อยๆ เห็นได้ชัดว่าไม่สามารถปกป้องทรัพย์สินโดดเดี่ยวของตนได้ ดังที่เห็นได้โดยการยึด Chios ในปี 1304 โดย Genoese Benedetto Zaccaria ผู้ซึ่งได้รับการรับรองการครอบครองของเขาจากจักรพรรดิ Andronikos II Palaiologos (r. (ค.ศ. 1282–1328) และกิจกรรมการแข่งขันของชาว Genoese และ Venetians ในพื้นที่ Dodecanese

การพิชิตโรดส์ของฮอสปิทัลเลอร์เกิดขึ้นในปี 1306–1310 Knights Hospitaller นำโดยปรมาจารย์ Foulques de Villaret ขึ้นบกบนเกาะในฤดูร้อนปี 1306 และยึดครองเกาะส่วนใหญ่ได้อย่างรวดเร็ว ยกเว้นเมืองโรดส์ซึ่งยังคงอยู่ในมือของไบแซนไทน์ จักรพรรดิอันโดรนิโกสที่ 2 ปาลาโอโลกอส ส่งกำลังเสริม ซึ่งทำให้เมืองสามารถต้านทานการโจมตีของฮอสปิทัลเลอร์ในช่วงแรกได้ และอดทนรอจนกระทั่งถูกยึดในวันที่ 15 สิงหาคม ค.ศ. 1310 พวกฮอสปิทัลเลอร์ได้ย้ายฐานทัพของตนไปยังเกาะ ซึ่งกลายเป็นศูนย์กลางของกิจกรรมของพวกเขาจนกระทั่งถูกยึดครองโดย จักรวรรดิออตโตมัน ในปี ค.ศ. 1522

ระหว่างสงครามครูเสดสเมียร์นีโอตในปี ค.ศ. 1344 เมื่อวันที่ 28 ตุลาคม กองกำลังผสมของอัศวินฮอสปิทัลเลอร์แห่งโรดส์ สาธารณรัฐเวนิส รัฐสันตะปาปา และราชอาณาจักรไซปรัส ได้ยึดทั้งท่าเรือและเมืองจากพวกเติร์ก ซึ่งพวกเขายึดครองได้เกือบ 60 ปี; ป้อมปราการพังทลายลงในปี 1348 โดยการตายของผู้ว่าการ Umur Baha ad-Din Ghazi

ในปี 1402 Tamerlane ได้บุกโจมตีเมืองและสังหารผู้คนเกือบทั้งหมด การพิชิตของ Timur เป็นเพียงชั่วคราวเท่านั้น แต่เมือง Smyrna ได้รับการฟื้นฟูโดยพวกเติร์กภายใต้ราชวงศ์ Aydın หลังจากนั้นมันก็กลายเป็น ออตโตมัน เมื่อพวกออตโตมานเข้ายึดครองดินแดนของ Aydın หลังปี 1425

เมื่อเผชิญหน้ากับ สุลต่านออตโตมัน ที่จัดตั้งขึ้นอย่างมั่นคงในขณะนี้ อัศวินฮอสปิทัลเลอร์ ซึ่งมีสำนักงานใหญ่อยู่บนเกาะโรดส์ ต้องการฐานที่มั่นอีกแห่งหนึ่งบนแผ่นดินใหญ่ ปรมาจารย์ Philibert de Naillac (1396–1421) ระบุสถานที่ที่เหมาะสมตรงข้ามเกาะ Kos ซึ่งเป็นที่ซึ่งปราสาทได้ถูกสร้างขึ้นโดยคณะ Order ที่ตั้งของที่นี่เป็นที่ตั้งของป้อมปราการในสมัยดอริก (1110 ปีก่อนคริสตศักราช) รวมถึงปราสาทเล็กๆ แห่งหนึ่งในเซลจุคในศตวรรษที่ 11

การก่อสร้างปราสาทเริ่มขึ้นในปี 1404 ภายใต้การดูแลของสถาปนิกอัศวินชาวเยอรมัน Heinrich Schlegelholt คนงานก่อสร้างได้รับการรับรองการจองในสวรรค์โดยพระราชกฤษฎีกาของสมเด็จพระสันตะปาปาปี 1409 พวกเขาใช้หินภูเขาไฟสีเขียวทรงสี่เหลี่ยม เสาหินอ่อน และภาพนูนจากสุสาน Halicarnassus ที่อยู่ใกล้เคียงเพื่อเสริมป้อมปราการ

ปราสาทแห่งนี้ถูกโจมตีพร้อมกับการผงาดขึ้นของจักรวรรดิออตโตมัน ครั้งแรกหลังจากการล่มสลายของกรุงคอนสแตนติโนเปิลในปี 1453 และอีกครั้งในปี 1480 โดยสุลต่าน เมห์เม็ดที่ 2 การโจมตีดังกล่าวถูกขับไล่โดยอัศวินแห่งเซนต์จอห์น เมื่ออัศวินตัดสินใจสร้างป้อมปราการให้กับปราสาทในปี 1494 พวกเขาใช้หินจากสุสานอีกครั้ง กำแพงที่หันหน้าไปทางแผ่นดินใหญ่นั้นหนาขึ้นเพื่อต้านทานพลังทำลายล้างที่เพิ่มขึ้นของปืนใหญ่ กำแพงที่หันหน้าไปทางทะเลมีความหนาน้อยกว่า เนื่องจากภาคีแทบไม่ต้องกลัวการโจมตีทางทะเลเนื่องจากกองเรือที่ทรงพลัง ปรมาจารย์ฟาบริซิโอ เดล การ์เรตโต (ค.ศ. 1513–1521) ได้สร้างป้อมปราการทรงกลมเพื่อเสริมความแข็งแกร่งให้กับฝั่งดินของป้อมปราการ

แม้จะมีป้อมปราการที่กว้างขวาง แต่หอคอยของพวกครูเซเดอร์ก็ไม่อาจเทียบได้กับกองกำลังของสุไลมานผู้ยิ่งใหญ่ซึ่งเอาชนะอัศวินในปี 1523 ภายใต้การปกครองของออตโตมัน ความสำคัญของปราสาทก็ลดน้อยลง และในปี 1895 ปราสาทก็ถูกดัดแปลงเป็นคุก

บนเกาะโรดส์ เหล่าฮอสปิทัลเลอร์ซึ่งในขณะนั้นเรียกกันว่าอัศวินแห่งโรดส์ ถูกบังคับให้กลายเป็นกองกำลังทหารมากขึ้น โดยต่อสู้กับโจรสลัดบาร์บารีโดยเฉพาะ พวกเขาต้านทานการรุกรานสองครั้งในศตวรรษที่ 15 ครั้งหนึ่งโดยสุลต่านแห่งอียิปต์ ในปี 1444 และอีกครั้งโดยสุลต่าน เมห์เหม็ดผู้พิชิต แห่ง ออตโตมัน ในปี 1480 ซึ่งหลังจากยึดคอนสแตนติโนเปิลและเอาชนะจักรวรรดิไบแซนไทน์ในปี 1453 ได้ทำให้อัศวินตกเป็นเป้าหมายสำคัญ

ในปี ค.ศ. 1522 กองกำลังรูปแบบใหม่ได้มาถึง: เรือ 400 ลำภายใต้การบังคับบัญชาของสุลต่าน สุไลมานผู้ยิ่งใหญ่ ได้ส่งกำลังทหาร 100,000 นายไปที่เกาะ (200,000 ในแหล่งอื่น) ในการต่อต้านกองกำลังนี้ อัศวินภายใต้การนำของปรมาจารย์ Philippe Villiers de L'Isle-Adam มีทหารประมาณ 7,000 นายและป้อมปราการของพวกเขา การปิดล้อมกินเวลานานหกเดือน เมื่อสิ้นสุดการที่ Hospitallers ที่พ่ายแพ้ที่รอดชีวิตได้รับอนุญาตให้ถอนตัวไปยังซิซิลี แม้จะพ่ายแพ้ แต่ทั้งคริสเตียนและมุสลิมก็ดูเหมือนจะถือว่าพฤติกรรมของฟิลลิปเป้ วิลลิเยร์ เดอ ลีล-อดัมมีความกล้าหาญอย่างยิ่ง และพระประมุขได้รับการประกาศให้เป็นผู้พิทักษ์ศรัทธาโดยสมเด็จพระสันตะปาปาอาเดรียนที่ 6

ในปี 1530 หลังจากย้ายจากที่หนึ่งไปยังอีกที่หนึ่งในยุโรปเป็นเวลาเจ็ดปี สมเด็จพระสันตะปาปาเคลมองต์ที่ 7 ซึ่งเป็นอัศวินเองได้บรรลุข้อตกลงกับพระเจ้าชาลส์ที่ 5 จักรพรรดิแห่งโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ รวมถึงกษัตริย์แห่งสเปน และซิซิลี เพื่อจัดหาที่พักถาวรของอัศวินในมอลตา โกโซและท่าเรือตริโปลีในแอฟริกาเหนือในศักดินาถาวรเพื่อแลกกับค่าธรรมเนียมรายปีของเหยี่ยวมอลตาตัวเดียว (เครื่องบรรณาการของเหยี่ยวมอลตา) ซึ่งพวกเขาจะส่งในวันวิญญาณทั้งหมดให้กับผู้แทนของกษัตริย์อุปราชแห่งซิซิลี ในปี ค.ศ. 1548 พระเจ้าชาร์ลส์ที่ 5 ได้ทรงยกไฮเทอร์สไฮม์ ซึ่งเป็นสำนักงานใหญ่ของกลุ่มฮอสพิทอลเลอร์ในเยอรมนี ขึ้นในอาณาเขตของไฮเทอร์สไฮม์ ทำให้ผู้ยิ่งใหญ่ของเยอรมนีกลายเป็นเจ้าชายแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ด้วยที่นั่งและลงคะแนนเสียงในรัฐสภาไรช์สทาค

ตริโปลีซึ่งปัจจุบันเป็นเมืองหลวงของลิเบีย ถูกปกครองโดยกลุ่มอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ระหว่างปี 1530 ถึง 1551 เมืองนี้อยู่ภายใต้การปกครองของสเปนมาเป็นเวลาสองทศวรรษก่อนที่จะได้รับมอบเป็นศักดินาให้กับพวกฮอสปิทัลเลอร์ในปี 1530 ร่วมกับหมู่เกาะมอลตาและโกโซ . พวกฮอสปิทัลเลอร์พบว่าการควบคุมทั้งเมืองและเกาะต่างๆ เป็นเรื่องยาก และในบางครั้งพวกเขาก็เสนอให้ย้ายสำนักงานใหญ่ไปที่ตริโปลี หรือไม่ก็ละทิ้งและทำลายล้างเมือง การปกครองตริโปลีของฮอสปิทอลสิ้นสุดลงในปี 1551 เมื่อเมืองนี้ถูก จักรวรรดิออตโตมัน ยึดครองหลังจากการปิดล้อม

ขณะที่ประจำการอยู่ในมอลตา ออร์เดอร์และกองทัพเรือได้เข้าร่วมในการรบทางเรือหลายครั้งกับกองทัพเรือออตโตมันหรือโจรสลัดบาร์บารี คณะออร์เดอร์ได้ส่งเรือบรรทุกเรือและห้องครัวสี่ลำเพื่อสนับสนุนจักรวรรดิสเปนและพันธมิตรในการพิชิตตูนิสในปี ค.ศ. 1535 นอกจากนี้ยังเข้าร่วมในยุทธการที่เปรเวซา (ค.ศ. 1538) คณะสำรวจแอลเจียร์ (ค.ศ. 1541) และยุทธการที่เจรบา (ค.ศ. 1560) ซึ่งพวกออตโตมานได้รับชัยชนะเหนือกองกำลังคริสเตียน

เรือเดินสมุทรสี่ลำของคณะ ได้แก่ ซานตาเฟ่ ซานมิเคเล่ ซานฟิลิปโป และซานคลอดิโอ ล่มด้วยพายุทอร์นาโดในแกรนด์ฮาร์เบอร์ในปี ค.ศ. 1555 เรือเหล่านั้นถูกแทนที่ด้วยเงินทุนที่ส่งมาจากสเปน รัฐสันตะปาปา ฝรั่งเศส และสำนักนายกรัฐมนตรีเซนต์ไจลส์ . ห้องครัวแห่งหนึ่งถูกสร้างขึ้นด้วยค่าใช้จ่ายของปรมาจารย์คลอดด์ เดอ ลา เซนเกิล

เมื่อเมืองวัลเลตตาเริ่มสร้างขึ้นในทศวรรษที่ 1560 มีแผนที่จะสร้างคลังแสงและมันดราคิโอสำหรับกองทัพเรือของภาคี คลังแสงไม่เคยถูกสร้างขึ้น และในขณะที่งานเริ่มต้นเกี่ยวกับมันดราคคิโอ มันก็หยุดลง และพื้นที่ดังกล่าวก็กลายเป็นสลัมที่รู้จักกันในชื่อมานเดรัจจิโอ ในที่สุด คลังแสงก็ถูกสร้างขึ้นในเมือง Birgu ในปี 1597 ท่าเรือถูกสร้างขึ้นในคูน้ำของ Valletta ในปี 1654 แต่ปิดในปี 1685

แม้ว่าจะยังคงอยู่บนมอลตา ออร์เดอร์ก็สูญเสียการถือครองในยุโรปไปจำนวนมากในระหว่างการปฏิรูปโปรเตสแตนต์ ทรัพย์สินของสาขาภาษาอังกฤษถูกยึดในปี 1540 ชาวเยอรมัน Bailiwick แห่งบรันเดินบวร์คกลายเป็นนิกายลูเธอรันในปี 1577 จากนั้นก็เป็นผู้เผยแพร่ศาสนาในวงกว้างมากขึ้น แต่ยังคงจ่ายเงินบริจาคให้กับ Order จนกระทั่งปี 1812 เมื่อกษัตริย์ Frederick ผู้พิทักษ์แห่ง Order ในปรัสเซีย พระเจ้าวิลเลียมที่ 3 ทรงเปลี่ยนให้เป็นลำดับบุญ

การล้อมเกาะมอลตาครั้งใหญ่เกิดขึ้นในปี ค.ศ. 1565 เมื่อ จักรวรรดิออตโตมัน พยายามยึดครองเกาะมอลตา ซึ่งในขณะนั้นถูกยึดครองโดยอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ การปิดล้อมกินเวลาเกือบสี่เดือน ตั้งแต่วันที่ 18 พฤษภาคม ถึง 11 กันยายน ค.ศ. 1565

Knights Hospitaller มีสำนักงานใหญ่ในมอลตาตั้งแต่ปี 1530 หลังจากถูกขับไล่ออกจากโรดส์โดยพวกออตโตมานเช่นกันในปี 1522 หลังจากการปิดล้อมโรดส์ พวกออตโตมานพยายามยึดมอลตาเป็นครั้งแรกในปี 1551 แต่ล้มเหลว ในปี ค.ศ. 1565 สุลต่านสุไลมานผู้ยิ่งใหญ่ สุลต่านออตโตมัน ได้พยายามยึดมอลตาเป็นครั้งที่สอง อัศวินซึ่งมีจำนวนประมาณ 500 นายพร้อมกับทหารราบประมาณ 6,000 นาย ยืนหยัดต่อการปิดล้อมและขับไล่ผู้รุกราน ชัยชนะครั้งนี้ได้กลายเป็นหนึ่งในเหตุการณ์ที่โด่งดังที่สุดของยุโรปในศตวรรษที่ 16 จนถึงจุดที่วอลแตร์กล่าวว่า "ไม่มีอะไรจะรู้ดีไปกว่าการล้อมเกาะมอลตา" ไม่ต้องสงสัยเลยว่ามีส่วนทำให้เกิดการกัดเซาะการรับรู้ของชาวยุโรปในเรื่องการอยู่ยงคงกระพันของออตโตมันในที่สุด แม้ว่าทะเลเมดิเตอร์เรเนียนจะยังคงถูกโต้แย้งระหว่างพันธมิตรที่นับถือศาสนาคริสต์และชาวเติร์กมุสลิมเป็นเวลาหลายปี

การล้อมเป็นจุดไคลแม็กซ์ของการแข่งขันที่ทวีความรุนแรงขึ้นระหว่างพันธมิตรคริสเตียนและจักรวรรดิออตโตมันอิสลามเพื่อควบคุมทะเลเมดิเตอร์เรเนียน การแข่งขันที่รวมถึงการโจมตีมอลตาของตุรกีในปี ค.ศ. 1551 การทำลายล้างกองเรือคริสเตียนที่เป็นพันธมิตรของออตโตมันในยุทธการที่เจรบาใน ค.ศ. 1560 และความพ่ายแพ้อย่างเด็ดขาดของออตโตมันในยุทธการเลปันโตในปี ค.ศ. 1571

หลังจากที่อัศวินย้ายไปยังมอลตา พวกเขาพบว่าตัวเองไม่มีเหตุผลในการดำรงอยู่ในตอนแรก การช่วยเหลือและเข้าร่วมสงครามครูเสดในดินแดนศักดิ์สิทธิ์ตอนนี้เป็นไปไม่ได้ ด้วยเหตุผลด้านกำลังทหารและการเงินพร้อมกับตำแหน่งทางภูมิศาสตร์ เนื่องจากรายได้ที่ลดลงจากผู้สนับสนุนชาวยุโรปไม่เต็มใจที่จะสนับสนุนองค์กรที่มีราคาแพงและไร้ความหมายอีกต่อไป อัศวินจึงหันมาดูแลทะเลเมดิเตอร์เรเนียนจากภัยคุกคามการละเมิดลิขสิทธิ์ที่เพิ่มขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งจากการคุกคามของโจรสลัดบาร์บารีที่ออตโตมันรับรองซึ่งปฏิบัติการจากชายฝั่งแอฟริกาเหนือ ได้รับแรงหนุนในช่วงปลายศตวรรษที่ 16 ด้วยอากาศแห่งความคงกระพันหลังจากการป้องกันเกาะของพวกเขาได้สำเร็จในปี 1565 และประกอบกับชัยชนะของชาวคริสเตียนเหนือกองเรือออตโตมันในยุทธการที่เลปันโตในปี 1571 อัศวินเหล่านี้เริ่มที่จะปกป้องพ่อค้าชาวคริสเตียนที่ส่งสินค้าไปและกลับ จากลิแวนต์และปลดปล่อยทาสคริสเตียนที่ถูกจับซึ่งเป็นรากฐานของการค้าขายและกองทัพเรือโจรสลัดบาร์บารี สิ่งนี้กลายเป็นที่รู้จักในชื่อ "คอร์โซ"

เจ้าหน้าที่ในมอลตาตระหนักทันทีถึงความสำคัญของการใช้ corsairing ต่อเศรษฐกิจของพวกเขา และเริ่มต้นที่จะสนับสนุนมัน ถึงแม้ว่าพวกเขาจะปฏิญาณว่าจะยากจน แต่อัศวินก็ยังได้รับความสามารถในการเก็บส่วนหนึ่งของ spoglio ซึ่งเป็นเงินรางวัลและสินค้าที่ได้รับจาก เรือที่ถูกยึดพร้อมกับความสามารถในการจัดห้องครัวของตัวเองด้วยความมั่งคั่งใหม่

การโต้เถียงครั้งใหญ่ที่เกิดขึ้นรอบคอร์โซของอัศวินคือการที่พวกเขายืนกรานต่อนโยบาย 'ทิวทัศน์' สิ่งนี้ทำให้คำสั่งซื้อสามารถหยุดและขึ้นเรือขนส่งทั้งหมดที่สงสัยว่าบรรทุกสินค้าตุรกี และยึดสินค้าที่จะขายต่อที่วัลเลตตา พร้อมด้วยลูกเรือซึ่งเป็นสินค้าที่มีค่าที่สุดบนเรือ โดยธรรมชาติแล้ว หลายประเทศอ้างว่าตกเป็นเหยื่อของความกระตือรือร้นของอัศวินที่จะหยุดและริบสินค้าใดๆ ที่เกี่ยวข้องกับพวกเติร์กจากระยะไกล ด้วยความพยายามที่จะควบคุมปัญหาที่กำลังเพิ่มมากขึ้น เจ้าหน้าที่ในมอลตาจึงได้จัดตั้งศาลตุลาการขึ้นที่ชื่อว่า Consiglio del Mer ซึ่งกัปตันที่รู้สึกว่าถูกทำผิดสามารถยื่นฟ้องในคดีของตนได้ ซึ่งมักจะประสบความสำเร็จ แนวปฏิบัติในการออกใบอนุญาตเอกชนและการรับรองจากรัฐซึ่งมีมาหลายปีแล้ว ได้รับการควบคุมอย่างเข้มงวดเนื่องจากรัฐบาลของเกาะพยายามที่จะดึงอัศวินไร้ยางอายและเอาใจมหาอำนาจของยุโรปและผู้อุปถัมภ์ที่มีจำกัด แต่ความพยายามเหล่านี้กลับไม่ประสบความสำเร็จเลย เนื่องจาก Consiglio del Mer ได้รับการร้องเรียนจำนวนมากในช่วงปี 1700 เกี่ยวกับการละเมิดลิขสิทธิ์มอลตาในภูมิภาค ท้ายที่สุดแล้ว การที่ปล่อยใจปล่อยตัวมากเกินไปในการอยู่เป็นส่วนตัวในทะเลเมดิเตอร์เรเนียนก็จะกลายเป็นความหายนะของอัศวินในช่วงเวลานี้ที่พวกเขาดำรงอยู่ เมื่อพวกเขาเปลี่ยนจากการทำหน้าที่เป็นด่านหน้าทางทหารของคริสต์ศาสนจักรที่เป็นเอกภาพไปสู่การเป็นรัฐชาติอีกแห่งหนึ่งในทวีปที่มุ่งเน้นเชิงพาณิชย์ ในไม่ช้าก็จะถูกครอบงำโดยประเทศการค้าแห่งทะเลเหนือ

กองทัพเรือฮอสปิทัลเลอร์เข้าร่วมใน สงครามออตโตมัน–เวนิส หลายครั้งในช่วงศตวรรษที่ 17 และต้นศตวรรษที่ 18 การสู้รบที่โดดเด่นคือการกระทำในวันที่ 28 กันยายน ค.ศ. 1644 ซึ่งนำไปสู่การปะทุของสงครามเครตัน กองทัพเรือถึงจุดสูงสุดในช่วงทศวรรษที่ 1680 ระหว่างที่ดำรงตำแหน่งผู้พิพากษา Gregorio Carafa เมื่อมาถึงจุดนี้ อู่ต่อเรือใน Birgu ก็ขยายใหญ่ขึ้น

ในช่วงสามทศวรรษสุดท้ายของศตวรรษที่ 18 คณะประสบความเสื่อมถอยอย่างต่อเนื่อง นี่เป็นผลมาจากปัจจัยหลายประการ รวมถึงการล้มละลายอันเป็นผลจากการปกครองอย่างฟุ่มเฟือยของปินโต ซึ่งทำให้การเงินของ Order หมดไป ด้วยเหตุนี้ออร์เดอร์จึงไม่เป็นที่นิยมของชาวมอลตา

ในปี ค.ศ. 1775 ในรัชสมัยของฟรานซิสโก ซีเมเนซ เด เตจาดา เกิดการจลาจลที่เรียกว่าการผงาดขึ้นของนักบวช กลุ่มกบฏสามารถยึดป้อมเซนต์เอลโมและนักบุญเจมส์ คาวาเลียร์ได้ แต่การก่อจลาจลถูกระงับ และผู้นำบางคนถูกประหารชีวิต ในขณะที่คนอื่นๆ ถูกจำคุกหรือถูกเนรเทศ

ในปี พ.ศ. 2335 ทรัพย์สินของคณะในฝรั่งเศสถูกรัฐยึดไปเนื่องจากการปฏิวัติฝรั่งเศส ซึ่งทำให้คณะที่ล้มละลายอยู่แล้วเข้าสู่วิกฤตทางการเงินที่ยิ่งใหญ่กว่า เมื่อนโปเลียนยกพลขึ้นบกที่มอลตาในเดือนมิถุนายน พ.ศ. 2341 เหล่าอัศวินอาจยืนหยัดต่อการปิดล้อมอันยาวนานได้ แต่พวกเขาก็ยอมจำนนเกาะนี้โดยแทบไม่ต้องสู้รบเลย

ในปี ค.ศ. 1798 ระหว่าง การเดินทางของนโปเลียนไปยังอียิปต์ นโปเลียนสามารถยึดเกาะมอลตาได้ นโปเลียนเรียกร้องจากปรมาจารย์เฟอร์ดินันด์ ฟอน ฮอมเปช ซู โบลไฮม์ว่าเรือของเขาได้รับอนุญาตให้เข้าไปในท่าเรือและรับน้ำและเสบียงได้ ปรมาจารย์ตอบว่าอนุญาตให้เรือต่างประเทศเข้าเทียบท่าได้ครั้งละสองลำเท่านั้น โบนาปาร์ตทราบดีว่าขั้นตอนดังกล่าวจะใช้เวลานานมากและจะทำให้กองกำลังของเขาเสี่ยงต่อพลเรือเอกเนลสัน จึงสั่งระดมปืนใหญ่โจมตีมอลตาทันที ทหารฝรั่งเศสขึ้นฝั่งที่มอลตาเมื่อถึงเจ็ดจุดในเช้าวันที่ 11 มิถุนายนและเข้าโจมตี หลังจากการต่อสู้อันดุเดือดเป็นเวลาหลายชั่วโมง ชาวมอลตาทางตะวันตกก็ถูกบังคับให้ยอมจำนน

นโปเลียนเปิดการเจรจากับเมืองหลวงของป้อมปราการแห่งวัลเลตตา เมื่อต้องเผชิญกับกองกำลังฝรั่งเศสที่มีอำนาจเหนือกว่าอย่างมากและการสูญเสียมอลตาตะวันตก ปรมาจารย์จึงเจรจายอมจำนนต่อการรุกราน Hompesch ออกจากมอลตาไปยัง Trieste เมื่อวันที่ 18 มิถุนายน เขาลาออกจากตำแหน่งปรมาจารย์เมื่อวันที่ 6 กรกฎาคม พ.ศ. 2342

อัศวินทั้งสองกระจัดกระจายไป แม้ว่าคำสั่งดังกล่าวยังคงมีอยู่ในรูปแบบที่ลดน้อยลง และได้เจรจากับรัฐบาลยุโรปเพื่อกลับคืนสู่อำนาจ จักรพรรดิพอลที่ 1 แห่งรัสเซีย ทรงประทานที่พักพิงแก่อัศวินจำนวนมากที่สุดในเซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก ซึ่งเป็นการกระทำที่ก่อให้เกิดประเพณีรัสเซียเกี่ยวกับอัศวินฮอสปิทัลเลอร์ และการยอมรับของคณะในหมู่คณะราชสำนักของจักรวรรดิรัสเซีย อัศวินผู้ลี้ภัยในเซนต์ปีเตอร์สเบิร์กได้เลือกซาร์พอลเป็นประมุขของพวกเขา ซึ่งเป็นคู่แข่งกับปรมาจารย์ฟอน ฮอมเพช จนกระทั่งการสละราชสมบัติของซาร์ในภายหลังทำให้พอลเป็นประมุขเพียงผู้เดียว ปรมาจารย์พอลที่ 1 ได้สร้าง "สำนักสงฆ์ใหญ่แห่งรัสเซีย" นอกเหนือจากสำนักสงฆ์นิกายโรมันคาธอลิก ไว้ไม่ต่ำกว่า 118 สำนัก ซึ่งทำให้ส่วนอื่นๆ ของคณะแคบลงและเปิดให้คริสตชนทุกคน การเลือกตั้งของพอลในฐานะปรมาจารย์ไม่เคยให้สัตยาบันภายใต้กฎหมายพระศาสนจักรนิกายโรมันคาธอลิก และเขาเป็นประมุขแห่งคณะโดยพฤตินัยมากกว่าโดยนิตินัย

ในปีพ.ศ. 2377 คณะซึ่งกลายเป็นที่รู้จักในนามคณะทหารอธิปไตยแห่งมอลตา ได้ก่อตั้งสำนักงานใหญ่ในสถานทูตเดิมในกรุงโรม ซึ่งยังคงอยู่มาจนถึงทุกวันนี้

งานในโรงพยาบาลซึ่งเป็นงานดั้งเดิมของคำสั่งนี้ กลายเป็นข้อกังวลหลักอีกครั้ง กิจกรรมโรงพยาบาลและสวัสดิการของคณะ ซึ่งดำเนินการในระดับมากใน สงครามโลกครั้งที่ 1 ได้รับการเข้มข้นขึ้นอย่างมากและขยายออกไปใน สงครามโลกครั้งที่สอง ภายใต้ปรมาจารย์ Fra' Ludovico Chigi Albani della Rovere (ปรมาจารย์ 1931–1951)