Nel 603 papa Gregorio I incaricò l'abate ravennate Probo, già emissario di Gregorio presso la corte longobarda, di costruire un ospedale a Gerusalemme per curare e prendersi cura dei pellegrini cristiani in Terra Santa. Nell'800 l'imperatore Carlo Magno ampliò l'ospedale di Probo e vi aggiunse una biblioteca. Circa 200 anni dopo, nel 1009, il califfo fatimide al-Hakim bi-Amr Allah distrusse l'ospedale e altri tremila edifici a Gerusalemme. Nel 1023, i mercanti di Amalfi e Salerno in Italia ottennero il permesso dal califfo Ali az-Zahir di ricostruire l'ospedale di Gerusalemme. L'ospedale era servito dall'Ordine di San Benedetto, costruito sul sito del monastero di San Giovanni Battista, e accoglieva i pellegrini cristiani in viaggio per visitare i luoghi santi cristiani.

Si ritiene quindi che l'Ospedale di San Giovanni sia stato fondato poco prima del 1070 a Gerusalemme, come dipendenza della casa benedettina della Chiesa di Santa Maria dei Latini. I mercanti amalfitani fondatori dedicarono questo ospizio a San Giovanni Battista, riflettendo la Basilica del Crocifisso di Amalfi, pre-vicentesca, dedicata all'Assunta. Poco dopo venne fondato un secondo ospizio femminile, dedicato a Santa Maria Maddalena. L'ospedale, nel quartiere Muristan di Gerusalemme, doveva fornire assistenza ai pellegrini malati, poveri o feriti diretti in Terra Santa.

L'ordine monastico ospedaliero fu creato in seguito alla Prima Crociata dal Beato Gerardo di Martigues il cui ruolo di fondatore venne confermato dalla bolla Pie postulatio voluntatis emessa da Papa Pasquale II nel 1113. Gerardo acquisì territori e rendite per il suo ordine in tutto il Regno di Gerusalemme e al di là. Sotto il suo successore, Raymond du Puy, l'ospizio originale fu ampliato fino a diventare un'infermeria vicino alla Chiesa del Santo Sepolcro a Gerusalemme. Inizialmente, il gruppo si prendeva cura dei pellegrini a Gerusalemme, ma l’ordine presto si estese per fornire ai pellegrini una scorta armata prima di diventare infine una forza militare significativa. Così l'Ordine di San Giovanni divenne impercettibilmente militarista senza perdere il suo carattere caritativo.

Raymond du Puy, succeduto a Gerardo come maestro dell'ospedale nel 1118, organizzò una milizia composta dai membri dell'ordine, dividendo l'ordine in tre ranghi: cavalieri, uomini d'arme e cappellani. Raimondo offrì il servizio delle sue truppe armate a Baldovino II di Gerusalemme, e l'ordine partecipò da questo momento alle crociate come ordine militare, distinguendosi in particolare nell'assedio di Ascalona del 1153.

Dopo il successo della Prima Crociata nella conquista di Gerusalemme nel 1099, molti crociati donarono la loro nuova proprietà nel Levante all'Ospedale di San Giovanni. Le prime donazioni furono rivolte al neonato Regno di Gerusalemme, ma col tempo l'ordine estese i suoi possedimenti agli stati crociati della Contea di Tripoli e al Principato di Antiochia. Le prove suggeriscono che intorno al 1130 l'ordine venne militarizzato quando Folco, re di Gerusalemme, concesse all'ordine il castello di recente costruzione a Beth Gibelin nel 1136. Una bolla papale del periodo compreso tra il 1139 e il 1143 potrebbe indicare che l'ordine assumeva persone per difendere i pellegrini. C'erano anche altri ordini militari, come i Cavalieri Templari , che offrivano protezione ai pellegrini.

Tra il 1142 e il 1144 Raimondo II, conte di Tripoli, concesse all'ordine i possedimenti della contea. Secondo lo storico Jonathan Riley-Smith, gli Ospitalieri stabilirono effettivamente un "palatinato" all'interno di Tripoli. La proprietà comprendeva castelli con i quali gli Ospitalieri avrebbero dovuto difendere Tripoli . Insieme al Krak des Chevaliers, agli Ospitalieri furono assegnati altri quattro castelli lungo i confini dello stato, che permisero all'ordine di dominare la zona. L'accordo dell'ordine con Raimondo II stabiliva che se non avesse accompagnato i cavalieri dell'ordine in campagna, il bottino apparteneva interamente all'ordine, e se era presente veniva diviso equamente tra il conte e l'ordine. Inoltre, Raimondo II non poteva fare la pace con i musulmani senza il permesso degli Ospitalieri. Gli Ospitalieri fecero del Krak des Chevaliers un centro amministrativo per la loro nuova proprietà, intraprendendo lavori al castello che lo avrebbero reso una delle fortificazioni crociate più elaborate del Levante.

Quando iniziò la Seconda Crociata nel 1147, gli Ospitalieri erano una forza importante nel regno e l'importanza politica del Gran Maestro era aumentata. Nel giugno 1148 al Concilio di Acri, Raymond du Puy fu tra i principi che presero la decisione di intraprendere l'assedio di Damasco. La colpa della conseguente disastrosa perdita fu attribuita ai Templari , non agli Ospitalieri. In Terra Santa l'influenza degli Ospitalieri divenne preponderante con un ruolo decisivo assunto nelle operazioni militari grazie al governo di Raimondo.

Il magistero di Jobert terminò con la sua morte nel 1177, e gli successe come Gran Maestro Roger de Moulins. A quel tempo, gli Ospitalieri formavano una delle più forti organizzazioni militari del regno, discostandosi dalla missione originaria dell'Ordine. Tra le prime azioni di Ruggero vi fu quello di sollecitare Baldovino IV di Gerusalemme a continuare a portare avanti vigorosamente la guerra contro Saladino e, nel novembre 1177, partecipò alla battaglia di Montgisard, ottenendo una vittoria contro gli Ayyubidi. Papa Alessandro III li richiamò all'osservanza della regola di Raymond du Puy tra il 1178 e il 1180, emanando una bolla che vietava loro di prendere le armi se non attaccati e li esortava a non abbandonare la cura dei malati e dei poveri. Alessandro III convinse Ruggero a stipulare una tregua nel 1179 con il templare Odo de St Amand, allora Gran Maestro, anch'egli veterano di Montgisard.

Nel 1186, Bertrand Mazoir vendette Margat agli Ospitalieri poiché era troppo costoso per la famiglia Mazoir mantenerla. Dopo qualche ricostruzione ed espansione da parte degli Ospitalieri, divenne il loro quartier generale in Siria. Sotto il controllo ospedaliero, le sue quattordici torri erano ritenute inespugnabili.

Molte delle fortificazioni cristiane più importanti in Terra Santa furono costruite dai Templari e dagli Ospitalieri. Al culmine del Regno di Gerusalemme, gli Ospitalieri possedevano sette grandi forti e altre 140 proprietà nella zona. I beni dell'Ordine erano divisi in priorati, suddivisi in baliati, a loro volta divisi in comanderie.

La battaglia di Hattin nel 1187 fu una disastrosa sconfitta per i crociati: Guido di Lusignano, re di Gerusalemme, fu catturato, così come la Vera Croce, una reliquia scoperta durante la Prima Crociata . Successivamente Saladino ordinò l'esecuzione dei cavalieri Templari e Ospitalieri catturati, tale era l'importanza dei due ordini nella difesa degli stati crociati. Dopo la battaglia, i castelli ospitalieri di Belmont, Belvoir e Bethgibelin caddero in mano agli eserciti musulmani. In seguito a queste perdite, l'Ordine concentrò la sua attenzione sui suoi castelli a Tripoli. Nel maggio 1188 Saladino guidò un esercito per attaccare il Krak des Chevaliers, ma vedendo il castello, decise che era troppo ben difeso e marciò invece sul castello ospitaliero di Margat, che non riuscì a catturare.

Verso la fine del 1189, Armengol de Aspa abdicò e un nuovo Gran Maestro non fu scelto finché Garnier di Nablus non fu eletto nel 1190. Garnier era stato gravemente ferito ad Hattin nel 1187, ma riuscì a raggiungere Ascalona e si riprese dalle ferite. In quel periodo era a Parigi in attesa della partenza di Riccardo I d'Inghilterra per la Terza Crociata . Arrivò a Messina il 23 settembre dove conobbe Philippe Auguste e Roberto IV de Sablé, futuro Gran Maestro dei Templari .

Garnier lasciò Messina il 10 aprile 1191 con la flotta di Riccardo, che poi ancorò il 1 maggio nel porto di Lemesos. Richard sottomise l'isola l'11 maggio nonostante la mediazione di Garnier. Salparono di nuovo il 5 giugno e arrivarono ad Acri, sotto il controllo ayyubide dal 1187. Lì trovarono Filippo Augusto a capo dell'assedio di Acri, un tentativo di due anni di cacciare i musulmani. Alla fine gli assedianti presero il sopravvento e, sotto gli occhi impotenti di Saladino, i difensori musulmani capitolarono il 12 luglio 1191.

Il 22 agosto 1191, Richard viaggiò a sud verso Arsuf. I Templari formavano l'avanguardia e gli Ospitalieri la retroguardia. Richard ha viaggiato con una forza d'élite pronta a intervenire ove necessario. Gli Ospitalieri furono attaccati il ​​7 settembre, all'inizio della battaglia di Arsuf. Situati nella parte posteriore della colonna militare, i cavalieri di Garnier erano sotto forte pressione da parte dei musulmani e lui avanzò per convincere Richard ad attaccare, cosa che rifiutò. Alla fine, Garnier e un altro cavaliere caricarono in avanti, e furono presto raggiunti dal resto delle forze ospedaliere. Richard, nonostante il fatto che i suoi ordini fossero stati disobbediti, fece segno di caricare completamente. Ciò colse il nemico in un momento vulnerabile e i suoi ranghi furono rotti. Garnier giocò quindi un ruolo importante nella vittoria della battaglia, anche se contravvenendo agli ordini di Richard.

Guérin de Montaigu fu eletto Gran Maestro nell'estate del 1207. Fu descritto come "la figura di uno dei più grandi maestri di cui l'Ospedale ha motivo di essere orgoglioso". Si ritiene che sia il fratello di Pierre de Montaigu che servì come Gran Maestro dei Templari dal 1218 al 1232. Come i suoi due predecessori, Montaigu si trovò coinvolto negli affari di Antiochia nella guerra di successione antiochena, iniziata con l'apertura del testamento di Boemondo III di Antiochia. Il testamento prevedeva come successore suo nipote Raymond-Roupen. Bohémondo IV di Antiochia, secondo figlio di Bohémondo III e conte di Tripoli, non accettò questo testamento. Leone I d'Armenia, in qualità di prozio materno, si schierò dalla parte di Raimondo-Roupen. Tuttavia, senza attendere la morte del padre, Bohémond IV aveva preso possesso del principato. I Templari si erano schierati con la borghesia di Antiochia e con az-Zahir Ghazi, il sultano ayyubide di Aleppo, mentre gli Ospitalieri si erano schierati con Raymond-Roupen e il re d'Armenia .

Quando de Montaigu rilevò gli Ospitalieri, nulla era cambiato. Leone I d'Armenia si era fatto signore di Antiochia e vi aveva ristabilito il suo pronipote. Ma fu di breve durata, e poiché il conte di Tripoli rimase padrone della città. Leone I sostenne le sue affermazioni confiscando le proprietà dei Templari in Cilicia, rovinando il commercio di Antiochia con incursioni e rischiando persino la scomunica nel 1210-1213. Fu raggiunto un accordo tra il re e i Templari e la scomunica fu revocata. Il 14 febbraio 1216 Antiochia fu messa nelle mani di Leone I e di suo nipote Raimondo Roupen. La nobiltà antiochena permise il ritorno di Bohémond IV e la fuga di Raimondo-Roupen, che morì poi nel 1222.

Bohémond IV si vendicò degli Ospitalieri, riprendendo loro il castello di Antiochia e minando i loro possedimenti di Tripoli. Onorio III intercedette in loro favore nel 1225 e nel 1226, e il suo successore Gregorio IX scomunicò Bohémond IV nel 1230. Autorizzò Gerald di Losanna, il patriarca latino di Gerusalemme, a revocare il divieto se Bohémond avesse accettato di fare la pace con gli Ospitalieri. Con la mediazione di Geraldo e degli Ibelin, Boemondo e gli Ospitalieri concordarono un trattato che fu firmato il 26 ottobre 1231. Bohémondo confermò il diritto degli Ospitalieri a tenere Jabala e una fortezza vicina e concesse loro feudi in denaro sia a Tripoli che ad Antiochia. Gli Ospitalieri rinunciarono ai privilegi che Raymond-Roupen aveva loro concesso. In breve tempo Geraldo di Losanna revocò la scomunica e inviò il trattato a Roma affinché fosse confermato dalla Santa Sede.

Nel 1244, gli Ayyubidi permisero ai Khwarazmiani, il cui impero era stato distrutto dai Mongoli nel 1231, di attaccare la città. I Templari iniziarono a fortificare la città di Gerusalemme nel 1244 quando si verificò l'invasione dei Corasmiani, una forza convocata da as-Salih Ayyub, il sultano d'Egitto . Presero Tiberiade, Safed e Tripoli e iniziarono l'assedio di Gerusalemme il 15 luglio 1244. A causa dell'accordo tra Federico II e al-Kamil, le mura furono inadeguatamente fortificate e incapaci di resistere all'attacco. Il patriarca di Gerusalemme Roberto di Nantes e i capi dei Templari e degli Ospitalieri vennero in aiuto degli abitanti della città e inizialmente respinsero gli aggressori. Nella battaglia persero la vita il castellano imperiale e il Gran Commendatore dell'Ospedale, ma dai Franchi non arrivò alcun aiuto.

La città cadde rapidamente. I Khwarazmiani saccheggiarono il quartiere armeno, dove decimarono la popolazione cristiana e scacciarono gli ebrei. Inoltre, saccheggiarono le tombe dei re di Gerusalemme nella Chiesa del Santo Sepolcro e dissotterrarono le loro ossa, in cui le tombe di Baldovino I e Goffredo di Buglione divennero cenotafi. Il 23 agosto, la Torre di Davide si arrese alle forze corasmiane e circa 6.000 uomini, donne e bambini cristiani marciarono fuori da Gerusalemme. I Cavalieri Ospitalieri e i Templari trasferirono il loro quartier generale nella città di Acri.

Dopo la caduta di Gerusalemme, fu riunita una forza combinata, composta da Templari , Ospitalieri e Cavalieri Teutonici , che si unirono a un esercito musulmano di siriani e transgiordani sotto al-Mansur Ibrahim e an-Nasir Dā'ūd. Questo esercito, posto sotto il comando di Gualtiero IV di Brienne, lasciò Acri, attuale sede dell'Ordine, e partì il 4 ottobre 1244. Cadde sui Corasmiani e sulle truppeegiziane comandate da Baibars, futuro sultanomamelucco d'Egitto, il 4 ottobre 1244. 17 ottobre. Nella battaglia di La Forbie vicino a Gaza, gli alleati musulmani dei Franchi si ritirarono al primo incontro con il nemico e i cristiani si ritrovarono soli. I combattimenti impari finirono in un disastro: 16.000 uomini persero la vita e 800 furono fatti prigionieri, tra cui 325 cavalieri e 200 turcopolieri degli Ospitalieri. Lo stesso Guillaume de Chateauneuf fu catturato e portato al Cairo. Solo 18 Templari e 16 Ospitalieri riuscirono a fuggire. La conseguente vittoria ayyubide portò alla convocazione della settima crociata e segnò il crollo del potere cristiano in Terra Santa.

Nel 1248 Papa Innocenzo IV approvò un abito militare standard da indossare durante la battaglia per gli Ospitalieri. Invece di un mantello chiuso sopra l'armatura (che limitava i loro movimenti), indossavano una sopravveste rossa con una croce bianca decorata su di essa.

Il 3 marzo 1271, l'esercito del sultanomamelucco Baibars arrivò al Krak des Chevaliers. Quando il Sultano arrivò, il castello potrebbe essere già stato bloccato dalle forze mamelucche per diversi giorni. Ci sono tre resoconti arabi dell'assedio; solo uno, quello di Ibn Shaddad, era di un contemporaneo sebbene non fosse presente. I contadini che vivevano nella zona erano fuggiti nel castello per sicurezza e furono tenuti nel cortile esterno. Non appena arrivò Baibars, iniziò a erigere mangonels, potenti armi d'assedio che avrebbe rivolto contro il castello. Secondo Ibn Shaddad, due giorni dopo la prima linea di difesa fu catturata dagli assedianti; probabilmente si riferiva ad un sobborgo murato fuori dall'ingresso del castello.

La pioggia interruppe l'assedio, ma il 21 marzo fu catturato un avamposto triangolare immediatamente a sud del Krak des Chevaliers, forse difeso da una palizzata di legno. Il 29 marzo la torre nell'angolo sud-ovest fu minata e crollò. L'esercito di Baibars attaccò attraverso la breccia ed entrando nel cortile esterno dove incontrò i contadini che avevano cercato rifugio nel castello.

Anche se il reparto esterno era caduto, e nel processo una manciata di soldati della guarnigione era stato ucciso, i crociati si ritirarono nel più formidabile reparto interno. Dopo una pausa di dieci giorni, gli assedianti trasmisero alla guarnigione una lettera, presumibilmente del Gran Maestro dei Cavalieri Ospitalieri di Tripoli, che concedeva loro il permesso di arrendersi. Sebbene la lettera fosse un falso, la guarnigione capitolò e il Sultano risparmiò loro la vita. I nuovi proprietari del castello intrapresero lavori di ristrutturazione, concentrati principalmente nel cortile esterno. La cappella ospedaliera fu trasformata in moschea e all'interno furono aggiunti due mihrab.

L'assedio di Acri (chiamato anche caduta di Acri) ebbe luogo nel 1291 e portò i crociati a perdere il controllo di Acri a favore deimamelucchi . È considerata una delle battaglie più importanti del periodo. Anche se il movimento crociato continuò per molti altri secoli, la conquista della città segnò la fine di ulteriori crociate nel Levante. Quando Acri cadde, i crociati persero la loro ultima grande roccaforte del Regno crociato di Gerusalemme. Mantenevano ancora una fortezza nella città settentrionale di Tartus (oggi nella Siria nord-occidentale), parteciparono ad alcune incursioni costiere e tentarono un'incursione dalla minuscola isola di Ruad, ma quando persero anche quella nel 1302 durante l'assedio di Ruad, i crociati non controllavano più alcuna parte della Terra Santa.

Dopo Acri, i Cavalieri Ospitalieri cercarono rifugio nel Regno di Cipro.

Gli Ospitalieri si trasferirono nel Regno di Cipro dopo la caduta di Acri. Rifugiatosi a Limassol presso il Castello di Kolossi, Jean de Villiers tenne il Capitolo Generale dell'Ordine il 6 ottobre 1292. Voleva mettere gli Ospitalieri in grado di riconquistare la Terra Santa. Si preparò alla difesa di Cipro e alla protezione dell'Armenia, entrambe minacciate daiMamelucchi . Impigliato nella politica cipriota, de Villaret formò un piano per acquisire un nuovo dominio temporale, l'isola di Rodi, allora parte dell'Impero bizantino.

Dopo la perdita di Acri, l'equilibrio di potere in Terra Santa tra cristiani e mamelucchi era chiaramente a favore di questi ultimi, che continuavano ad avanzare. Tuttavia i cristiani potevano contare sui mongoli di Persia guidati da Mahmud Ghazan Khan, il cui espansionismo li spinse a bramare le terre mamelucche. Il suo esercito prese Aleppo, e lì si unì al suo vassallo Hethum II d' Armenia , le cui forze includevano alcuni Templari e Ospitalieri, i quali parteciparono tutti al resto dell'offensiva. I mongoli e i loro alleati sconfissero i mamelucchi nella terza battaglia di Homs nel dicembre 1299. Il khan inviò un ambasciatore a Nicosia per stabilire un'alleanza. Enrico II di Cipro, Hethum II e il Gran Maestro Templare Jacques de Molay decisero di farlo scortare dal papa per sostenere l'idea di un'alleanza, che divenne effettiva nel 1300.

Il re di Cipro inviò in Armenia un esercito accompagnato da 300 cavalieri dei due Ordini guidati personalmente dai Gran Maestri. Hanno preso d'assalto l'isola di Ruad, vicino alla costa siriana, con l'obiettivo di trasformarla in una base per le loro future operazioni. Poi presero la città portuale di Tortosa, saccheggiarono la regione, catturarono molti musulmani e li vendettero come schiavi in ​​Armenia mentre aspettavano l'arrivo dei Mongoli, ma questo portò solo alla caduta di Ruad, l'ultima battaglia per la Terra Santa.

Quando gli Ospitalieri si ritirarono a Cipro, l'isola era governata dal re titolare di Gerusalemme, Enrico II di Cipro. Non era affatto contento che un'organizzazione potente come l'Ordine potesse competere con lui per la sovranità della sua piccola isola e probabilmente avviare Guillaume de Villaret sulla strada della conquista dell'isola di Rodi.

Secondo Gérard de Monréal, appena eletto Gran Maestro dei Cavalieri Ospitalieri nel 1305, Foulques de Villaret pianificò la conquista di Rodi, che gli avrebbe assicurato una libertà d'azione che non avrebbe potuto avere finché fosse rimasto l'Ordine. su Cipro e fornirebbe una nuova base per la guerra contro i turchi.

Rodi era un obiettivo attraente: un'isola fertile, era strategicamente situata al largo della costa sud-occidentale dell'Asia Minore, a cavallo delle rotte commerciali verso Costantinopoli o Alessandria e il Levante. L'isola era un possedimento bizantino, ma l'Impero sempre più debole non era evidentemente in grado di proteggere i suoi possedimenti insulari, come dimostrato dalla presa di Chios nel 1304 da parte del genovese Benedetto Zaccaria, che ottenne il riconoscimento del suo possedimento dall'imperatore Andronico II Paleologo (r. 1282–1328), e le attività concorrenti di genovesi e veneziani nell'area del Dodecaneso.

La conquista ospedaliera di Rodi ebbe luogo nel 1306–1310. I Cavalieri Ospitalieri, guidati dal Gran Maestro Foulques de Villaret, sbarcarono sull'isola nell'estate del 1306 e ne conquistarono rapidamente gran parte ad eccezione della città di Rodi, che rimase in mano bizantina. L'imperatore Andronico II Paleologo inviò rinforzi, che permisero alla città di respingere i primi attacchi ospedalieri e di perseverare fino alla sua cattura il 15 agosto 1310. Gli Ospitalieri trasferirono la loro base sull'isola, che divenne il centro delle loro attività finché non fu conquistata da l' Impero Ottomano nel 1522.

Durante la Crociata di Smirnione del 1344, il 28 ottobre, le forze combinate dei Cavalieri Ospitalieri di Rodi, della Repubblica di Venezia , dello Stato Pontificio e del Regno di Cipro, conquistarono ai turchi sia il porto che la città, che mantennero per quasi 60 anni; la cittadella cadde nel 1348, con la morte del governatore Umur Baha ad-Din Ghazi.

Nel 1402 Tamerlano prese d'assalto la città e massacrò quasi tutti gli abitanti. La conquista di Timur fu solo temporanea, ma Smirne fu recuperata dai turchi sotto la dinastia Aydın, dopo di che divenne ottomana , quando gli Ottomani conquistarono le terre di Aydın dopo il 1425.

Di fronte al sultanato ottomano ormai saldamente consolidato, i Cavalieri Ospitalieri, il cui quartier generale era sull'isola di Rodi, avevano bisogno di un'altra roccaforte sulla terraferma. Il Gran Maestro Philibert de Naillac (1396–1421) identificò un sito adatto di fronte all'isola di Kos, dove l'Ordine aveva già costruito un castello. La sua posizione era sede di una fortificazione in epoca dorica (1110 a.C.) e di un piccolo castello selgiuchide nell'XI secolo.

La costruzione del castello iniziò nel 1404 sotto la supervisione dell'architetto cavaliere tedesco Heinrich Schlegelholt. Ai lavoratori edili fu garantita una riserva in paradiso da un decreto papale del 1409. Per fortificare il castello utilizzarono pietra vulcanica verde squadrata, colonne di marmo e rilievi provenienti dal vicino Mausoleo di Alicarnasso.

Il castello venne attaccato con l'ascesa dell'Impero Ottomano, prima dopo la caduta di Costantinopoli nel 1453 e di nuovo nel 1480 dal sultano Mehmed II . Gli attacchi furono respinti dai Cavalieri di San Giovanni. Quando i Cavalieri decisero di fortificare il castello nel 1494, utilizzarono ancora una volta le pietre del Mausoleo. Le mura rivolte verso la terraferma furono ispessite per resistere al crescente potere distruttivo dei cannoni. Le mura rivolte verso il mare erano meno spesse, poiché l'Ordine aveva poco da temere da un attacco dal mare grazie alla sua potente flotta navale. Il Gran Maestro Fabrizio del Carretto (1513–21) costruì un bastione circolare per rafforzare il lato terra della fortezza.

Nonostante le loro estese fortificazioni, le torri dei crociati non potevano competere con le forze di Solimano il Magnifico, che sconfisse i cavalieri nel 1523. Sotto il dominio ottomano, l'importanza del castello diminuì e nel 1895 fu trasformato in una prigione.

A Rodi gli Ospitalieri, da allora chiamati anche Cavalieri di Rodi, furono costretti a diventare una forza più militarizzata, combattendo soprattutto con i pirati barbareschi. Resistettero a due invasioni nel XV secolo, una da parte del Sultano d'Egitto nel 1444 e un'altra da parte del sultano ottomano Mehmed il Conquistatore nel 1480 che, dopo aver catturato Costantinopoli e sconfitto l'Impero bizantino nel 1453, fece dei Cavalieri un obiettivo prioritario.

Nel 1522 arrivò un tipo di forza completamente nuovo: 400 navi al comando del sultano Solimano il Magnifico trasportarono sull'isola 100.000 uomini (200.000 secondo altre fonti). Contro questa forza i Cavalieri, sotto il Gran Maestro Philippe Villiers de L'Isle-Adam, disponevano di circa 7.000 uomini d'arme e delle loro fortificazioni. L'assedio durò sei mesi, al termine dei quali gli Ospitalieri sopravvissuti e sconfitti poterono ritirarsi in Sicilia. Nonostante la sconfitta, sia i cristiani che i musulmani sembrano aver considerato la condotta di Phillipe Villiers de L'Isle-Adam estremamente valorosa, e il Gran Maestro fu proclamato Difensore della Fede da Papa Adriano VI.

Nel 1530, dopo sette anni di spostamenti da un luogo all'altro in Europa, Papa Clemente VII – egli stesso un cavaliere – raggiunse un accordo con Carlo V, imperatore del Sacro Romano Impero, anche re diSpagna e Sicilia, per fornire ai cavalieri quartieri permanenti a Malta, Gozo e il porto nordafricano di Tripoli in feudo perpetuo in cambio di una quota annuale di un singolo falco maltese (l'Omaggio del Falco Maltese), che dovevano inviare nel giorno dei defunti al rappresentante del Re, il Viceré di Sicilia Nel 1548, Carlo V elevò Heitersheim, il quartier generale degli Ospitalieri in Germania, a Principato di Heitersheim, rendendo il Gran Priore di Germania un principe del Sacro Romano Impero con un seggio e un voto nel Reichstag.

Tripoli, oggi capitale della Libia, fu governata dai Cavalieri Ospitalieri tra il 1530 e il 1551. La città fu sotto il dominio spagnolo per due decenni prima di essere concessa in feudo agli Ospitalieri nel 1530 insieme alle isole di Malta e Gozo . Gli Ospitalieri trovarono difficile controllare sia la città che le isole, e a volte proposero di spostare il loro quartier generale a Tripoli o di abbandonare e radere al suolo la città. Il dominio ospedaliero su Tripoli terminò nel 1551 quando la città fu conquistata dall'Impero Ottomano a seguito di un assedio.

Mentre si trovavano a Malta, l'Ordine e la sua marina parteciparono a numerose battaglie navali contro la marina ottomana o i pirati barbareschi. L'Ordine inviò una caracca e quattro galee per sostenere l'Impero spagnolo e i suoi alleati nella conquista di Tunisi nel 1535. Partecipò anche alla battaglia di Preveza (1538), alla spedizione di Algeri (1541) e alla battaglia di Djerba (1560), in cui gli Ottomani vinsero sulle forze cristiane.

Quattro galee dell'Ordine, Santa Fè, San Michele, San Filippo e San Claudio, si capovolsero in un tornado nel Porto Grande nel 1555. Furono sostituite con fondi inviati dalla Spagna, dallo Stato Pontificio, dalla Francia e dal Priore di St. Giles . Una galea fu costruita a spese del Gran Maestro Claude de la Sengle.

Quando, intorno al 1560, si iniziò la costruzione della città di La Valletta, si progettava di costruire un arsenale e un mandracchio per la marina dell'Ordine. L'arsenale non fu mai costruito e, mentre iniziavano i lavori sul mandracchio, si fermarono e la zona divenne una baraccopoli conosciuta come il Manderaggio. Alla fine, nel 1597 fu costruito un arsenale a Birgu. Nel 1654 fu costruito un molo nel fosso di La Valletta, ma fu chiuso nel 1685.

Anche se sopravvisse a Malta, l’Ordine perse molti dei suoi possedimenti europei durante la Riforma protestante. Le proprietà del ramo inglese furono confiscate nel 1540. Il Baliato tedesco di Brandeburgo divenne luterano nel 1577, poi più ampiamente evangelico, ma continuò a pagare il suo contributo finanziario all'Ordine fino al 1812, quando il Protettore dell'Ordine in Prussia, Re Federico Guglielmo III, lo trasformò in un ordine al merito.

Il Grande Assedio di Malta avvenne nel 1565 quando l' Impero Ottomano tentò di conquistare l'isola di Malta, allora detenuta dai Cavalieri Ospitalieri. L'assedio durò quasi quattro mesi, dal 18 maggio all'11 settembre 1565.

I Cavalieri Ospitalieri avevano sede a Malta dal 1530, dopo essere stati cacciati da Rodi, sempre dagli Ottomani, nel 1522, in seguito all'assedio di Rodi. Gli Ottomani tentarono per la prima volta di conquistare Malta nel 1551 ma fallirono. Nel 1565, Solimano il Magnifico, il sultano ottomano, fece un secondo tentativo di conquistare Malta. I cavalieri, che erano circa 500 insieme a circa 6.000 fanti, resistettero all'assedio e respinsero gli invasori. Questa vittoria divenne uno degli eventi più celebrati dell'Europa del XVI secolo, al punto che Voltaire affermò: "Niente è più noto dell'assedio di Malta". Indubbiamente contribuì all’erosione della percezione europea dell’invincibilità ottomana, sebbene per molti anni il Mediterraneo continuò a essere conteso tra le coalizioni cristiane e i turchi musulmani.

L'assedio fu il culmine di una crescente competizione tra le alleanze cristiane e l'Impero Ottomano islamico per il controllo del Mediterraneo, una competizione che includeva l'attacco turco a Malta nel 1551, la distruzione ottomana di una flotta cristiana alleata nella battaglia di Djerba nel 1551. 1560 e la decisiva sconfitta ottomana nella battaglia di Lepanto nel 1571.

In seguito al trasferimento dei cavalieri a Malta, essi si erano ritrovati privi della loro iniziale ragione di esistenza: assistere e unirsi ai crociati in Terra Santa era ormai impossibile, per ragioni di forza militare e finanziaria oltre che di posizione geografica. Con la diminuzione delle entrate provenienti dagli sponsor europei non più disposti a sostenere un'organizzazione costosa e priva di significato, i cavalieri si dedicarono alla sorveglianza del Mediterraneo dalla crescente minaccia della pirateria, in particolare dalla minaccia dei pirati barbareschi appoggiati dagli ottomani che operavano dalla costa nordafricana. Spinti verso la fine del XVI secolo da un'aria di invincibilità dopo la riuscita difesa della loro isola nel 1565 e aggravata dalla vittoria cristiana sulla flotta ottomana nella battaglia di Lepanto nel 1571, i cavalieri iniziarono a proteggere la navigazione mercantile cristiana verso e dal Levante e liberando gli schiavi cristiani catturati che costituivano la base del commercio piratesco e delle marinerie dei corsari barbareschi. Questo divenne noto come il "corso".

Le autorità di Malta riconobbero immediatamente l'importanza della corsara per la loro economia e iniziarono ad incoraggiarla, poiché nonostante i loro voti di povertà, ai Cavalieri fu concessa la possibilità di trattenere una parte dello spoglio, che era il premio in denaro e il carico guadagnato da un nave catturata, insieme alla capacità di equipaggiare le proprie galere con la loro nuova ricchezza.

La grande controversia che circondò il Corso dei Cavalieri fu la loro insistenza sulla loro politica di “vista”. Ciò ha consentito all'Ordine di fermare e salire a bordo di tutte le navi sospettate di trasportare merci turche e di confiscare il carico per rivenderlo a La Valletta, insieme all'equipaggio della nave, che era di gran lunga la merce più preziosa a bordo della nave. Naturalmente molte nazioni affermarono di essere vittime dell'eccessiva ansia dei cavalieri di fermare e confiscare qualsiasi bene lontanamente collegato ai turchi. Nel tentativo di regolamentare il problema crescente, le autorità maltesi hanno istituito un tribunale giudiziario, il Consiglio del Mer, dove i capitani che si sentivano offesi potevano far valere la loro causa, spesso con successo. La pratica di rilasciare licenze di corsara e quindi l'approvazione statale, che esisteva da diversi anni, era strettamente regolamentata mentre il governo dell'isola tentava di trascinare cavalieri senza scrupoli e compiacere le potenze europee e i benefattori limitati. Tuttavia questi sforzi non ebbero del tutto successo, poiché intorno al 1700 il Consiglio del Mer ricevette numerose denunce di pirateria maltese nella regione. In definitiva, la dilagante eccessiva indulgenza alla corsara nel Mediterraneo doveva essere la rovina dei cavalieri in questo particolare periodo della loro esistenza mentre si trasformavano da avamposto militare di una cristianità unita a diventare un altro stato-nazione in un continente orientato al commercio. presto superato dalle nazioni mercantili del Mare del Nord.

La marina ospedaliera partecipò a numerose guerre ottomano-veneziane nel XVII e all'inizio del XVIII secolo. Un impegno notevole fu l'azione del 28 settembre 1644, che portò allo scoppio della guerra di Creta. La marineria raggiunse il suo apice negli anni ottanta del Seicento, durante la magistratura di Gregorio Carafa. A questo punto il cantiere navale di Birgu fu ampliato.

Negli ultimi tre decenni del Settecento l'Ordine conobbe un costante declino. Ciò fu il risultato di una serie di fattori, inclusa la bancarotta derivante dal sontuoso governo di Pinto, che prosciugò le finanze dell'Ordine. A causa di ciò, l'Ordine divenne impopolare anche tra i maltesi.

Nel 1775, durante il regno di Francisco Ximénez de Tejada, si verificò una rivolta conosciuta come la Rivolta dei Preti. I ribelli riuscirono a catturare Fort St Elmo e Saint James Cavalier, ma la rivolta fu repressa e alcuni dei leader furono giustiziati mentre altri furono imprigionati o esiliati.

Nel 1792, i possedimenti dell'Ordine in Francia furono sequestrati dallo Stato a causa della Rivoluzione francese, che portò l'Ordine già in bancarotta in una crisi finanziaria ancora maggiore. Quando Napoleone sbarcò a Malta nel giugno 1798, i cavalieri avrebbero potuto resistere a un lungo assedio, ma si arresero quasi senza combattere.

Nel 1798, durante la spedizione napoleonica in Egitto , Napoleone conquistò Malta. Napoleone chiese al Gran Maestro Ferdinand von Hompesch zu Bolheim che le sue navi potessero entrare nel porto e imbarcare acqua e rifornimenti. Il Gran Maestro rispose che solo due navi straniere alla volta potevano entrare nel porto. Bonaparte, consapevole che una tale procedura avrebbe richiesto molto tempo e avrebbe lasciato le sue forze vulnerabili all'ammiraglio Nelson, ordinò immediatamente una raffica di cannoni contro Malta. I soldati francesi sbarcarono a Malta in sette punti la mattina dell'11 giugno e attaccarono. Dopo diverse ore di aspri combattimenti, i maltesi ad ovest furono costretti ad arrendersi.

Napoleone aprì i negoziati con la capitale fortezza di La Valletta. Di fronte alla superiorità delle forze francesi e alla perdita della parte occidentale di Malta, il Gran Maestro negoziò la resa all'invasione. Hompesch lasciò Malta per Trieste il 18 giugno. Si dimise da Gran Maestro il 6 luglio 1799.

I cavalieri furono dispersi, anche se l'ordine continuò ad esistere in forma ridotta e negoziò con i governi europei per un ritorno al potere. L' imperatore russo Paolo I ospitò il maggior numero di cavalieri a San Pietroburgo, un'azione che diede origine alla tradizione russa dei Cavalieri Ospitalieri e al riconoscimento dell'Ordine tra gli Ordini Imperiali Russi. I cavalieri rifugiati a San Pietroburgo procedettero all'elezione dello Zar Paolo come loro Gran Maestro, un rivale del Gran Maestro von Hompesch fino a quando l'abdicazione di quest'ultimo lasciò Paolo come unico Gran Maestro. Il Gran Maestro Paolo I creò, oltre al Gran Priorato cattolico romano, un "Gran Priorato russo" di non meno di 118 Comanderie, facendo impallidire il resto dell'Ordine e aperto a tutti i cristiani. L'elezione di Paolo a Gran Maestro non fu mai ratificata dal diritto canonico cattolico romano, ed egli fu de facto piuttosto che de jure Gran Maestro dell'Ordine.

Nel 1834 l'Ordine, che divenne noto come Sovrano Militare Ordine di Malta, stabilì la sua sede presso l'ex ambasciata a Roma, dove si trova ancora oggi.

Il lavoro ospedaliero, opera originaria dell'Ordine, torna ad essere la sua principale preoccupazione. L'attività ospedaliera ed assistenziale dell'Ordine, intrapresa su vasta scala durante la Prima Guerra Mondiale , venne notevolmente intensificata e ampliata durante la Seconda Guerra Mondiale sotto il Gran Maestro Fra' Ludovico Chigi Albani della Rovere (Gran Maestro 1931–1951).