Vào thế kỷ 16, các phong trào Cải cách Tin lành đã xâm nhập sâu vào Cơ đốc giáo Ba Lan và kết quả là Cải cách ở Ba Lan liên quan đến một số giáo phái khác nhau.Các chính sách khoan dung tôn giáo phát triển ở Ba Lan gần như là duy nhất ở châu Âu vào thời điểm đó và nhiều người chạy trốn khỏi các khu vực bị chia cắt bởi xung đột tôn giáo đã tìm được nơi ẩn náu ở Ba Lan.Các triều đại của Vua Sigismund I the Old (1506–1548) và Vua Sigismund II Augustus (1548–1572) đã chứng kiến ​​sự phát triển mạnh mẽ của văn hóa và khoa học (Thời kỳ Hoàng kim của Phục hưng ở Ba Lan), trong đó có nhà thiên văn học Nicolaus Copernicus (1473) –1543) là đại diện nổi tiếng nhất.Jan Kochanowski (1530–1584) là một nhà thơ và là nhân vật nghệ thuật hàng đầu của thời kỳ này.Năm 1525, dưới triều đại của Sigismund I, Dòng Teutonic được thế tục hóa và Công tước Albert đã thực hiện một hành động tỏ lòng kính trọng trước nhà vua Ba Lan (Sự kính trọng của Phổ) đối với thái ấp của ông, Công quốc Phổ.Mazovia cuối cùng đã được sáp nhập hoàn toàn vào Vương quốc Ba Lan vào năm 1529.Triều đại của Sigismund II đã kết thúc thời kỳ Jagiellonian, nhưng đã tạo ra Liên minh Lublin (1569), một sự hoàn thành cuối cùng của liên minh với Litva.Thỏa thuận này đã chuyển Ukraine từ Đại công quốc Litva sang Ba Lan và biến chính thể Ba Lan-Litva thành một liên minh thực sự, bảo tồn nó sau cái chết của Sigismund II không con, người mà sự tham gia tích cực của ông đã giúp hoàn thành quá trình này.Livonia ở cực đông bắc được Ba Lan hợp nhất vào năm 1561 và Ba Lan tham gia Chiến tranh Livonia chống lại Sa hoàng của Nga .Phong trào hành quyết, cố gắng kiểm tra sự thống trị ngày càng tăng đối với nhà nước của các gia đình tài phiệt Ba Lan và Litva, lên đến đỉnh điểm tại Sejm ở Piotrków vào năm 1562–63.Về mặt tôn giáo, Hội Anh em Ba Lan tách khỏi những người theo thuyết Calvin, và Kinh thánh Brest của đạo Tin lành được xuất bản năm 1563. Các tu sĩ Dòng Tên, đến năm 1564, được định sẵn là sẽ tạo ra tác động lớn đến lịch sử Ba Lan.