16. yüzyılda, Protestan Reformu hareketleri Polonya Hristiyanlığına derin bir giriş yaptı ve bunun sonucunda Polonya'da Reform bir dizi farklı mezhep içeriyordu.Polonya'da geliştirilen dini hoşgörü politikaları, o zamanlar Avrupa'da neredeyse benzersizdi ve dini çekişmelerle parçalanmış bölgelerden kaçanların çoğu Polonya'ya sığındı.Kral Sigismund I the Old (1506-1548) ve Kral Sigismund II Augustus'un (1548-1572) hükümdarlıkları, astronom Nicolaus Copernicus'un (1473) dahil olduğu yoğun bir kültür ve bilim gelişimine (Polonya'da Rönesans'ın Altın Çağı) tanık oldu. –1543) en iyi bilinen temsilcisidir.Jan Kochanowski (1530–1584) bir şair ve dönemin önde gelen sanatçı kişiliğiydi.1525'te, I. Sigismund'un hükümdarlığı sırasında, Cermen Tarikatı laikleştirildi ve Dük Albert, tımarı Prusya Dükalığı için Polonya kralı (Prusya Saygısı) önünde bir saygı duruşunda bulundu.Mazovia nihayet 1529'da tamamen Polonya Kraliyetine dahil edildi.Sigismund II'nin saltanatı Jagiellonian dönemini sona erdirdi, ancak Litvanya ile birliğin nihai olarak yerine getirilmesi olan Lublin Birliği'ne (1569) yol açtı.Bu anlaşma Ukrayna'yı Litvanya Büyük Dükalığı'ndan Polonya'ya devretti ve Polonya-Litvanya yönetimini gerçek bir birliğe dönüştürdü ve onu, aktif katılımı bu sürecin tamamlanmasını mümkün kılan çocuksuz II. Sigismund'un ölümünün ötesinde korudu.Uzak kuzeydoğudaki Livonia, 1561'de Polonya'nın bünyesine katıldı ve Polonya, Rusya Çarlığı'na karşı Livonya Savaşı'na girdi.Devletin Polonya ve Litvanya'nın kodaman ailelerinin ilerleyen hakimiyetini kontrol etmeye çalışan infazcı hareket, 1562-63'te Piotrków'daki Sejm'de zirveye ulaştı.Dini cephede, Polonyalı Kardeşler Kalvinistlerden ayrıldı ve Protestan Brest İncili 1563'te yayınlandı. 1564'te gelen Cizvitlerin kaderinde Polonya'nın tarihi üzerinde büyük bir etki yapmak vardı.