În secolul al XVI-lea, mișcările de reformă protestantă au făcut incursiuni profunde în creștinismul polonez, iar reforma rezultată din Polonia a implicat o serie de confesiuni diferite.Politicile de toleranță religioasă care s-au dezvoltat în Polonia erau aproape unice în Europa la acea vreme și mulți dintre cei care au fugit din regiuni sfâșiate de conflictele religioase și-au găsit refugiu în Polonia.Domnia regelui Sigismund I cel Bătrân (1506–1548) și a regelui Sigismund al II-lea Augustus (1548–1572) au fost martorii unei cultivări intense a culturii și științei (o Epocă de Aur a Renașterii în Polonia), dintre care astronomul Nicolaus Copernic (1473). –1543) este cel mai cunoscut reprezentant.Jan Kochanowski (1530–1584) a fost un poet și principala personalitate artistică a perioadei.În 1525, în timpul domniei lui Sigismund I, Ordinul Teuton a fost secularizat și ducele Albert a îndeplinit un act de omagiu în fața regelui polonez (Omagiul Prusac) pentru fieful său, Ducatul Prusiei.Mazovia a fost în cele din urmă încorporată complet în coroana poloneză în 1529.Domnia lui Sigismund al II-lea a pus capăt perioadei jageloniene, dar a dat naștere Unirii de la Lublin (1569), o ultimă împlinire a unirii cu Lituania.Acest acord a transferat Ucraina din Marele Ducat al Lituaniei în Polonia și a transformat politica polono-lituaniană într-o uniune reală, păstrând-o dincolo de moartea fără copii Sigismund al II-lea, a cărui implicare activă a făcut posibilă finalizarea acestui proces.Livonia din nord-estul îndepărtat a fost încorporată de Polonia în 1561, iar Polonia a intrat în războiul Livonian împotriva țaratului Rusiei .Mișcarea execuționistă, care a încercat să controleze progresul dominației statului de către familiile de magnați din Polonia și Lituania, a atins apogeul la Sejm din Piotrków în 1562–63.Pe frontul religios, frații polonezi s-au despărțit de calvini, iar Biblia protestantă de la Brest a fost publicată în 1563. Iezuiții, care au sosit în 1564, erau destinați să aibă un impact major asupra istoriei Poloniei.