A 16. században a protestáns reformációs mozgalmak mélyen behatoltak a lengyel kereszténységbe, és az ebből következő lengyelországi reformáció számos különböző felekezetet érintett.A Lengyelországban kialakult vallási tolerancia politikája akkoriban szinte egyedülálló volt Európában, és sokan, akik a vallási viszályok sújtotta régiókból menekültek el, Lengyelországban találtak menedéket.I. Öreg Zsigmond király (1506–1548) és II. Augustus Zsigmond király (1548–1572) uralkodása a kultúra és a tudomány intenzív művelésének (a lengyelországi reneszánsz aranykorának) volt tanúja, amelyről Miklós Kopernikusz (1473) csillagász. –1543) a legismertebb képviselője.Jan Kochanowski (1530–1584) költő volt, a korszak kiemelkedő művészeti személyisége.1525-ben, I. Zsigmond uralkodása alatt a Német Lovagrendet elvilágiasították, és Albert herceg hódolatot hajtott végre a lengyel király előtt (a Porosz Homage) hűbérének, a Porosz Hercegségnek.Mazóvia végül 1529-ben került be a lengyel koronába.II. Zsigmond uralkodása véget vetett a Jagelló-korszaknak, de létrejött a lublini unió (1569), ami a Litvániával való unió végső beteljesülése.Ez a megállapodás Ukrajnát a Litván Nagyhercegségtől Lengyelországhoz helyezte át, és a lengyel–litván államot valóságos unióvá alakította át, megőrizve azt a gyermektelen II. Zsigmond halálán túl is, akinek aktív közreműködése lehetővé tette ennek a folyamatnak a lezárását.A távoli északkeleti Livóniát 1561-ben Lengyelország bekebelezte, és Lengyelország belépett a Livónia háborúba az orosz cárság ellen.A végrehajtó mozgalom, amely megpróbálta megfékezni a lengyel és litván mágnáscsaládok előretörő államuralmát, 1562–63-ban a piotrkówi szejmben tetőzött.Vallási fronton a lengyel testvérek elszakadtak a reformátusoktól, és 1563-ban megjelent a protestáns Breszti Biblia. Az 1564-ben érkezett jezsuitáknak nagy hatást kellett gyakorolniuk Lengyelország történelmére.