در قرن شانزدهم، جنبش‌های اصلاح‌طلب پروتستان نفوذ عمیقی به مسیحیت لهستانی کردند و اصلاحات حاصله در لهستان تعدادی فرقه‌های مختلف را در بر گرفت.سیاست‌های تساهل مذهبی که در لهستان توسعه یافت تقریباً در آن زمان در اروپا منحصربه‌فرد بود و بسیاری از کسانی که از مناطقی که درگیری‌های مذهبی دریده بودند گریختند به لهستان پناه بردند.دوران سلطنت شاه زیگیزموند اول پیر (1506-1548) و شاه زیگیسموند دوم آگوستوس (1548-1572) شاهد رشد شدید فرهنگ و علم (عصر طلایی رنسانس در لهستان) بود که ستاره شناس نیکلاس کوپرنیک (1473) –1543) شناخته شده ترین نماینده است.یان کوچانوفسکی (1530-1584) شاعر و برترین شخصیت هنری آن دوره بود.در سال 1525، در زمان سلطنت زیگیسموند اول، فرقه توتونی سکولاریزه شد و دوک آلبرت در برابر پادشاه لهستان (ادای احترام پروس) برای خانواده اش، دوک نشین پروس، ادای احترام کرد.مازوویا سرانجام در سال 1529 به طور کامل در تاج لهستان گنجانده شد.سلطنت زیگیزموند دوم به دوره یاگیلونی پایان داد، اما اتحادیه لوبلین (1569) را به وجود آورد، که تحقق نهایی اتحادیه با لیتوانی بود.این قرارداد اوکراین را از دوک نشین بزرگ لیتوانی به لهستان منتقل کرد و سیاست لهستان-لیتوانی را به یک اتحادیه واقعی تبدیل کرد و آن را فراتر از مرگ سیگیزموند دوم بدون فرزند حفظ کرد، که مشارکت فعال او تکمیل این فرآیند را ممکن کرد.لیوونیا در شمال شرق دور توسط لهستان در سال 1561 گنجانیده شد و لهستان وارد جنگ لیوونی علیه تزاروم روسیه شد.جنبش اعدام‌گرایان که تلاش می‌کرد تسلط رو به رشد دولت توسط خانواده‌های بزرگ لهستان و لیتوانی را بررسی کند، در سجم در پیوترکوف در سال‌های 1562-1563 به اوج خود رسید.در جبهه مذهبی، برادران لهستانی از کالوینیست ها جدا شدند و کتاب مقدس برست پروتستان در سال 1563 منتشر شد. یسوعیان که در سال 1564 وارد شدند، قرار بود تأثیر زیادی بر تاریخ لهستان بگذارند.