Sau cuộc chiến tranh năm 1547–49 với người Toungoo, vua Ayutthaya Maha Chakkraphat đã xây dựng hệ thống phòng thủ thủ đô của mình để chuẩn bị cho cuộc chiến sau này với người Miến Điện.Chiến tranh 1547–49 kết thúc với chiến thắng phòng thủ của Xiêm và bảo toàn nền độc lập của Xiêm.Tuy nhiên, tham vọng lãnh thổ của Bayinnaung đã thúc đẩy Chakkraphat chuẩn bị cho một cuộc xâm lược khác.Những sự chuẩn bị này bao gồm một cuộc điều tra dân số nhằm chuẩn bị cho tất cả những người có khả năng tham chiến.Chính phủ tịch thu vũ khí và gia súc để chuẩn bị cho một nỗ lực chiến tranh quy mô lớn, và bảy con voi trắng bị Chakkraphat bắt để cầu may.Tin tức về sự chuẩn bị của vua Ayutthaya nhanh chóng lan truyền, cuối cùng đến tận người Miến Điện.Bayinnaung đã thành công trong việc chiếm thành phố Chiang Mai thuộc vương quốc Lan Na gần đó vào năm 1556. Những nỗ lực tiếp theo đã khiến phần lớn miền bắc Xiêm nằm dưới sự kiểm soát của Miến Điện.Điều này khiến vương quốc của Chakkraphat rơi vào tình thế bấp bênh, phải đối mặt với lãnh thổ của kẻ thù ở phía bắc và phía tây.Bayinnaung sau đó đã yêu cầu hai con voi trắng của Vua Chakkraphat để cống nạp cho Vương triều Toungoo đang trỗi dậy.Chakkraphat từ chối, dẫn đến cuộc xâm lược lần thứ hai của Miến Điện vào Vương quốc Ayutthaya.Quân đội Bayinnaung hành quân xuống Ayutthaya.Ở đó, họ bị pháo đài của quân Xiêm giữ lại trong nhiều tuần, với sự hỗ trợ của ba tàu chiến Bồ Đào Nha và các khẩu đội pháo binh ở bến cảng.Những kẻ xâm lược cuối cùng đã chiếm được các tàu và khẩu đội của Bồ Đào Nha vào ngày 7 tháng 2 năm 1564, sau đó pháo đài nhanh chóng thất thủ.^[43] Với lực lượng hiện nay gồm 60.000 người kết hợp với quân đội Phitsanulok, Bayinnaung đã tiến tới các bức tường thành của Ayutthaya, bắn phá dữ dội thành phố.Dù vượt trội về sức mạnh nhưng quân Miến Điện không chiếm được Ayutthaya mà yêu cầu vua Xiêm ra khỏi thành phố dưới lá cờ đình chiến để đàm phán hòa bình.Nhận thấy người dân của mình không thể chịu đựng cuộc bao vây lâu hơn nữa, Chakkraphat đã thương lượng hòa bình nhưng phải trả giá đắt.Để đổi lấy sự rút lui của quân đội Miến Điện, Bayinnaung đã bắt Hoàng tử Ramesuan (con trai của Chakkraphat), Phraya Chakri và Phraya Sunthorn Songkhram cùng anh ta trở về Miến Điện làm con tin và bốn con voi trắng Xiêm.Mahathamraja, mặc dù là một kẻ phản bội, nhưng vẫn được giữ lại làm người cai trị Phitsanulok và phó vương của Xiêm.Vương quốc Ayutthaya trở thành chư hầu của Vương triều Toungoo, được yêu cầu trao ba mươi con voi và ba trăm catty bạc cho người Miến Điện hàng năm.