No século 16, os movimentos da Reforma Protestante fizeram profundas incursões no cristianismo polonês e a Reforma resultante na Polônia envolveu várias denominações diferentes.As políticas de tolerância religiosa que se desenvolveram na Polônia eram quase únicas na Europa naquela época e muitos que fugiram de regiões dilaceradas por conflitos religiosos encontraram refúgio na Polônia.Os reinados do rei Sigismundo I, o Velho (1506–1548) e do rei Sigismundo II Augusto (1548–1572) testemunharam um intenso cultivo da cultura e da ciência (uma Era de Ouro do Renascimento na Polônia), da qual o astrônomo Nicolau Copérnico (1473 –1543) é o representante mais conhecido.Jan Kochanowski (1530–1584) foi um poeta e a principal personalidade artística do período.Em 1525, durante o reinado de Sigismundo I, a Ordem Teutônica foi secularizada e o Duque Alberto realizou um ato de homenagem ao rei polonês (a Homenagem Prussiana) para seu feudo, o Ducado da Prússia.Mazovia foi finalmente totalmente incorporada à Coroa polonesa em 1529.O reinado de Sigismundo II encerrou o período Jagiellonian, mas deu origem à União de Lublin (1569), um cumprimento final da união com a Lituânia.Este acordo transferiu a Ucrânia do Grão-Ducado da Lituânia para a Polônia e transformou a política polaco-lituana em uma união real, preservando-a além da morte do sem filhos Sigismundo II, cujo envolvimento ativo tornou possível a conclusão deste processo.A Livônia, no extremo nordeste, foi incorporada pela Polônia em 1561 e a Polônia entrou na Guerra da Livônia contra o czarismo da Rússia .O movimento execucionista, que tentou conter a progressiva dominação do estado pelas famílias dos magnatas da Polônia e da Lituânia, atingiu o pico no Sejm em Piotrków em 1562-63.Na frente religiosa, os irmãos poloneses se separaram dos calvinistas, e a Bíblia protestante de Brest foi publicada em 1563. Os jesuítas, que chegaram em 1564, estavam destinados a causar um grande impacto na história da Polônia.