במאה ה-16, תנועות הרפורמציה הפרוטסטנטיות עשו חדירה עמוקה לנצרות הפולנית והרפורמה שנוצרה בפולין כללה מספר זרמים שונים.מדיניות הסובלנות הדתית שהתפתחה בפולין הייתה כמעט ייחודית באירופה באותה תקופה ורבים שברחו מאזורים שנקרעו במאבקי דת מצאו מקלט בפולין.תקופת שלטונם של המלך זיגיסמונד הראשון הישן (1506–1548) והמלך זיגיסמונד השני אוגוסטוס (1548–1572) היו עדים לטיפוח אינטנסיבי של תרבות ומדע (תור הזהב של הרנסנס בפולין), מתוכם האסטרונום ניקולאוס קופרניקוס (1473). -1543) הוא הנציג הידוע ביותר.יאן קוצ'נובסקי (1530–1584) היה משורר והאישיות האמנותית הבכירה של התקופה.בשנת 1525, בתקופת שלטונו של זיגיסמונד הראשון, חולל המסדר הטבטוני והדוכס אלברט ביצע מעשה הומאז' בפני המלך הפולני (ההומאז' הפרוסי) למחנכתו, דוכסות פרוסיה.מאזוביה שולבה לבסוף במלואה בכתר הפולני ב-1529.שלטונו של זיגיסמונד השני סיים את התקופה היגילונית, אך הוליד את איחוד לובלין (1569), הגשמה אולטימטיבית של האיחוד עם ליטא.הסכם זה העביר את אוקראינה מהדוכסות הגדולה של ליטא לפולין והפך את הפוליטיקה הפולנית-ליטאית לאיחוד אמיתי, תוך שמר עליה מעבר למותו של זיגיסמונד השני חסר הילדים, שמעורבותו הפעילה אפשרה את השלמת תהליך זה.ליבוניה בצפון-מזרח הרחוק התאגדה על ידי פולין בשנת 1561 ופולין נכנסה למלחמת ליבוניה נגד הצאר של רוסיה .תנועת ההוצאה לפועל, שניסתה לבדוק את השליטה המתקדמת במדינה על ידי משפחות המגדלים של פולין וליטא, הגיעה לשיאה בסי'ם בפיוטרקוב בשנים 1562–63.במישור הדתי, האחים הפולנים התפצלו מהקלוויניסטים, והתנ"ך הפרוטסטנטי של ברסט פורסם בשנת 1563. הישועים, שהגיעו בשנת 1564, נועדו להשפיע רבות על ההיסטוריה של פולין.