1500-luvulla protestanttiset uskonpuhdistusliikkeet tunkeutuivat syvälle Puolan kristinuskoon, ja siitä seurannut uskonpuhdistus Puolassa koski useita eri kirkkokuntia.Puolassa kehittynyt uskonnollisen suvaitsevaisuuden politiikka oli tuolloin lähes ainutlaatuista Euroopassa, ja monet uskonnollisen kiistan repimiä alueita pakenneet löysivät turvan Puolassa.Kuningas Sigismund I Vanhan (1506–1548) ja kuningas Sigismund II Augustuksen (1548–1572) hallituskausi osoitti intensiivistä kulttuurin ja tieteen viljelyä (renessanssin kulta-aika Puolassa), josta tähtitieteilijä Nikolaus Kopernik (1473) –1543) on tunnetuin edustaja.Jan Kochanowski (1530–1584) oli runoilija ja aikakauden merkittävin taiteellinen persoona.Vuonna 1525, Sigismund I:n vallan aikana, Saksalaisritarikunta maallistettiin ja herttua Albert suoritti kunnianosoituksen Puolan kuninkaalle (Preussin kunnianosoitus) hänen läänilleen, Preussin herttuakunnalle.Masovia liitettiin lopulta täysin Puolan kruunuun vuonna 1529.Sigismund II:n hallituskausi päätti Jagellon-kauden, mutta synnytti Lublinin liiton (1569), mikä oli lopullinen liiton toteutuminen Liettuan kanssa.Sopimus siirsi Ukrainan Liettuan suurruhtinaskunnalta Puolaan ja muutti Puolan ja Liettuan valtion todelliseksi liitoksi, joka säilytti sen lapsettoman Sigismund II:n kuoleman jälkeen, jonka aktiivinen osallistuminen mahdollisti tämän prosessin loppuunsaattamisen.Kaukoidän Liivinmaa liitettiin Puolaan vuonna 1561 ja Puola osallistui Liivinmaan sotaan Venäjän tsaarinkuntaa vastaan.Teloitusliike, joka yritti estää Puolan ja Liettuan suurmiesperheiden etenevän valtion vallan, saavutti huippunsa Piotrkówin Sejmissä vuosina 1562–1563.Uskonnollisella rintamalla puolalaiset veljet erosivat kalvinisteista, ja protestanttinen Brestin Raamattu julkaistiin vuonna 1563. Vuonna 1564 saapuneiden jesuiitojen oli tarkoitus tehdä suuri vaikutus Puolan historiaan.