Noong ika-16 na siglo, ang mga kilusang Protestant Reformation ay gumawa ng malalim na pagpasok sa Polish na Kristiyanismo at ang nagresultang Repormasyon sa Poland ay nagsasangkot ng ilang iba't ibang mga denominasyon.Ang mga patakaran ng pagpaparaya sa relihiyon na nabuo sa Poland ay halos natatangi sa Europa noong panahong iyon at marami sa mga tumakas sa mga rehiyong sinira ng hidwaan sa relihiyon ay nakahanap ng kanlungan sa Poland.Ang mga paghahari ni Haring Sigismund I the Old (1506–1548) at Haring Sigismund II Augustus (1548–1572) ay nasaksihan ang matinding paglilinang ng kultura at agham (isang Ginintuang Panahon ng Renaissance sa Poland), kung saan ang astronomer na si Nicolaus Copernicus (1473). –1543) ay ang pinakakilalang kinatawan.Si Jan Kochanowski (1530–1584) ay isang makata at ang nangungunang artistikong personalidad ng panahong iyon.Noong 1525, sa panahon ng paghahari ni Sigismund I, ang Teutonic Order ay sekularisasyon at si Duke Albert ay nagsagawa ng isang gawa ng pagpupugay sa harap ng hari ng Poland (ang Prussian Homage) para sa kanyang fief, ang Duchy of Prussia.Ang Mazovia ay ganap na naisama sa Polish Crown noong 1529.Ang paghahari ng Sigismund II ay nagwakas sa panahon ng Jagiellonian, ngunit nagbunga ng Unyon ng Lublin (1569), isang pangwakas na katuparan ng unyon sa Lithuania.Inilipat ng kasunduang ito ang Ukraine mula sa Grand Duchy ng Lithuania patungo sa Poland at ginawang isang tunay na unyon ang Polish–Lithuanian polity, na pinanatili ito sa kabila ng pagkamatay ng walang anak na Sigismund II, na ang aktibong pakikilahok ay naging posible upang makumpleto ang prosesong ito.Ang Livonia sa malayong hilagang-silangan ay isinama ng Poland noong 1561 at ang Poland ay pumasok sa Livonian War laban sa Tsardom ng Russia .Ang kilusang executionist, na nagtangkang suriin ang umuunlad na dominasyon ng estado ng mga magnate na pamilya ng Poland at Lithuania, ay umakyat sa Sejm sa Piotrków noong 1562–63.Sa larangan ng relihiyon, ang Polish Brethren ay humiwalay sa mga Calvinista, at ang Protestant Brest Bible ay inilathala noong 1563. Ang mga Heswita, na dumating noong 1564, ay nakatakdang gumawa ng malaking epekto sa kasaysayan ng Poland.