Pas luftës së viteve 1547–49 me Toungoo, mbreti Ayutthaya Maha Chakkraphat ndërtoi mbrojtjen e kryeqytetit të tij në përgatitje për një luftë të mëvonshme me birmanezët.Lufta e viteve 1547–49 përfundoi me një fitore mbrojtëse siameze dhe ruajti pavarësinë siameze.Megjithatë, ambiciet territoriale të Bayinnaung e shtynë Chakkraphat të përgatitej për një pushtim tjetër.Këto përgatitje përfshinin një regjistrim që përgatiti të gjithë njerëzit e aftë për të shkuar në luftë.Armët dhe bagëtitë u morën nga qeveria në përgatitje për një përpjekje lufte në shkallë të gjerë dhe shtatë elefantë të bardhë u kapën nga Chakkraphat për fat të mirë.Lajmet për përgatitjen e mbretit Ayutthayan u përhapën shpejt, duke arritur përfundimisht te birmanezët.Bayinnaung arriti të merrte qytetin e Chiang Mai në mbretërinë e afërt Lan Na në 1556. Përpjekjet e mëvonshme lanë pjesën më të madhe të Siamit verior nën kontrollin e Birmanisë.Kjo e la mbretërinë e Chakkraphat në një pozicion të pasigurt, përballë territorit armik në veri dhe perëndim.Bayinnaung më pas kërkoi dy nga elefantët e bardhë të mbretit Chakkraphat si haraç për dinastinë Toungoo në rritje.Chakkraphat refuzoi, duke çuar në pushtimin e dytë të Mbretërisë Ayutthaya nga Birmania .Ushtritë e Bayinnaung marshuan deri në Ayutthaya.Atje, ata u mbajtën në gji për javë të tëra nga fortesa siameze, të ndihmuar nga tre anije luftarake portugeze dhe bateri artilerie në port.Pushtuesit më në fund kapën anijet dhe bateritë portugeze më 7 shkurt 1564, pas së cilës fortesa ra menjëherë.^[43] Me një forcë tashmë 60,000 të kombinuar me ushtrinë Phitsanulok, Bayinnaung arriti në muret e qytetit Ayutthaya, duke bombarduar rëndë qytetin.Megjithëse superiorë në forcë, birmanezët nuk ishin në gjendje të kapnin Ayutthaya, por kërkuan që mbreti siamez të dilte nga qyteti nën një flamur armëpushimi për negociatat e paqes.Duke parë që qytetarët e tij nuk mund ta duronin më gjatë rrethimin, Chakkraphat negocioi paqen, por me një çmim të lartë.Në këmbim të tërheqjes së ushtrisë birmaneze, Bayinnaung mori Princin Ramesuan (djalin e Chakkraphat), Phraya Chakri dhe Phraya Sunthorn Songkhram me vete në Burma si peng, dhe katër elefantë të bardhë siamezë.Mahathamraja, edhe pse një tradhtar, do të lihej si sundimtar i Phitsanulok dhe mëkëmbës i Siamit.Mbretëria Ayutthaya u bë një vasal i dinastisë Toungoo, nga i cili kërkohej t'u jepte burmezëve çdo vit tridhjetë elefantë dhe treqind mace argjendi.