Pada abad ke-16, gerakan Reformasi Protestan telah menembusi jauh ke dalam agama Kristian Poland dan Reformasi yang terhasil di Poland melibatkan beberapa denominasi yang berbeza.Dasar toleransi beragama yang berkembang di Poland hampir unik di Eropah pada masa itu dan ramai yang melarikan diri dari kawasan yang dilanda perbalahan agama mendapat perlindungan di Poland.Pemerintahan Raja Sigismund I the Old (1506–1548) dan Raja Sigismund II Augustus (1548–1572) menyaksikan penanaman budaya dan sains yang sengit (Zaman Keemasan Renaissance di Poland), di mana ahli astronomi Nicolaus Copernicus (1473). –1543) ialah wakil yang paling terkenal.Jan Kochanowski (1530–1584) ialah seorang penyair dan personaliti artistik utama pada zaman itu.Pada tahun 1525, semasa pemerintahan Sigismund I, Ordo Teutonik telah disekularkan dan Duke Albert melakukan tindakan penghormatan di hadapan raja Poland (Penghormatan Prusia) untuk wilayahnya, Kadipaten Prusia.Mazovia akhirnya dimasukkan sepenuhnya ke dalam Mahkota Poland pada tahun 1529.Pemerintahan Sigismund II menamatkan zaman Jagiellonian, tetapi menimbulkan Kesatuan Lublin (1569), pemenuhan muktamad kesatuan dengan Lithuania.Perjanjian ini memindahkan Ukraine dari Grand Duchy of Lithuania ke Poland dan mengubah kerajaan Poland-Lithuania menjadi kesatuan sebenar, memeliharanya selepas kematian Sigismund II yang tidak mempunyai anak, yang penglibatan aktifnya membolehkan proses ini selesai.Livonia di timur laut jauh telah diperbadankan oleh Poland pada tahun 1561 dan Poland memasuki Perang Livonia menentang Tsardom Rusia .Pergerakan eksekusi, yang cuba untuk memeriksa penguasaan negara yang semakin maju oleh keluarga besar Poland dan Lithuania, memuncak di Sejm di Piotrków pada 1562–63.Dari segi agama, Polish Brethren berpecah daripada Calvinis, dan Protestant Brest Bible diterbitkan pada tahun 1563. Jesuit, yang tiba pada tahun 1564, telah ditakdirkan untuk memberi kesan besar kepada sejarah Poland.