Pada abad ke-16, gerakan Reformasi Protestan masuk jauh ke dalam kekristenan Polandia dan Reformasi yang dihasilkan di Polandia melibatkan sejumlah denominasi yang berbeda.Kebijakan toleransi beragama yang dikembangkan di Polandia hampir unik di Eropa pada waktu itu dan banyak orang yang melarikan diri dari daerah yang terkoyak oleh perselisihan agama menemukan perlindungan di Polandia.Pemerintahan Raja Sigismund I yang Tua (1506–1548) dan Raja Sigismund II Augustus (1548–1572) menyaksikan budidaya budaya dan sains yang intens (Zaman Keemasan Renaisans di Polandia), di mana astronom Nicolaus Copernicus (1473) –1543) adalah perwakilan paling terkenal.Jan Kochanowski (1530–1584) adalah seorang penyair dan kepribadian artistik terkemuka pada masa itu.Pada tahun 1525, pada masa pemerintahan Sigismund I, Ordo Teutonik disekularisasi dan Adipati Albert melakukan tindakan penghormatan di hadapan raja Polandia (Penghormatan Prusia) atas wilayah kekuasaannya, Kadipaten Prusia.Mazovia akhirnya sepenuhnya dimasukkan ke dalam Kerajaan Polandia pada tahun 1529.Pemerintahan Sigismund II mengakhiri periode Jagiellonian, tetapi memunculkan Persatuan Lublin (1569), pemenuhan terakhir persatuan dengan Lituania.Perjanjian ini memindahkan Ukraina dari Kadipaten Agung Lituania ke Polandia dan mengubah pemerintahan Polandia-Lithuania menjadi persatuan yang nyata, mempertahankannya setelah kematian Sigismund II yang tidak memiliki anak, yang keterlibatan aktifnya memungkinkan penyelesaian proses ini.Livonia di timur laut jauh digabungkan oleh Polandia pada tahun 1561 dan Polandia memasuki Perang Livonia melawan Ketsaran Rusia .Gerakan algojo, yang mencoba menghentikan dominasi negara oleh keluarga terkemuka Polandia dan Lituania, mencapai puncaknya di Sejm di Piotrków pada tahun 1562–63.Di bidang agama, Persaudaraan Polandia berpisah dari Calvinis, dan Alkitab Brest Protestan diterbitkan pada tahun 1563. Jesuit, yang tiba pada tahun 1564, ditakdirkan untuk memberikan pengaruh besar pada sejarah Polandia.