U 16. stoljeću protestantski reformacijski pokreti duboko su prodrli u poljsko kršćanstvo, a rezultirajuća reformacija u Poljskoj uključila je niz različitih denominacija.Politika vjerske tolerancije koja se razvila u Poljskoj bila je gotovo jedinstvena u Europi tog vremena i mnogi koji su pobjegli iz regija razdiranih vjerskim sukobima našli su utočište u Poljskoj.Za vladavine kralja Žigmunda I. Starog (1506. – 1548.) i kralja Žigmunda II. –1543) je najpoznatiji predstavnik.Jan Kochanowski (1530. – 1584.) bio je pjesnik i vrhunska umjetnička ličnost tog razdoblja.Godine 1525., za vrijeme vladavine Sigismunda I., Teutonski red je sekulariziran i vojvoda Albert je pred poljskim kraljem izvršio čin počasti (Pruska počast) za njegov feud, Vojvodstvo Prusku.Mazovija je konačno u potpunosti uključena u Poljsku krunu 1529.Vladavina Sigismunda II. završila je jagelonsko razdoblje, ali je dovela do Lublinske unije (1569.), konačnog ispunjenja unije s Litvom.Ovim je sporazumom Ukrajina prebačena iz Velikog Vojvodstva Litve u Poljsku i transformirao poljsko-litvansko državno uređenje u stvarnu uniju, očuvajući ga nakon smrti Žigmunda II. bez djece, čija je aktivna uključenost omogućila završetak ovog procesa.Poljska je 1561. pripojila Livoniju na krajnjem sjeveroistoku i Poljska je ušla u Livonski rat protiv ruskog carstva .Egzekucionistički pokret, koji je pokušao zaustaviti sve veću dominaciju magnatskih obitelji Poljske i Litve nad državom, dosegao je vrhunac na Sejmu u Piotrkówu 1562–63.Na vjerskom planu, Poljska braća odvojila su se od kalvinista, a protestantska Brestova Biblija objavljena je 1563. Isusovcima, koji su stigli 1564., bilo je suđeno da izvrše veliki utjecaj na povijest Poljske.