En el siglo XVI, los movimientos de Reforma protestante hicieron incursiones profundas en el cristianismo polaco y la Reforma resultante en Polonia involucró a varias denominaciones diferentes.Las políticas de tolerancia religiosa que se desarrollaron en Polonia fueron casi únicas en Europa en ese momento y muchos de los que huyeron de regiones desgarradas por conflictos religiosos encontraron refugio en Polonia.Los reinados del rey Segismundo I el Viejo (1506-1548) y del rey Segismundo II Augusto (1548-1572) fueron testigos de un intenso cultivo de la cultura y la ciencia (una Edad de Oro del Renacimiento en Polonia), de la cual el astrónomo Nicolaus Copernicus (1473 –1543) es el representante más conocido.Jan Kochanowski (1530-1584) fue un poeta y la principal personalidad artística de la época.En 1525, durante el reinado de Segismundo I, la Orden Teutónica fue secularizada y el Duque Alberto realizó un acto de homenaje ante el rey polaco (el Homenaje de Prusia) por su feudo, el Ducado de Prusia.Mazovia finalmente se incorporó por completo a la Corona polaca en 1529.El reinado de Segismundo II puso fin al período jagielloniano, pero dio lugar a la Unión de Lublin (1569), el cumplimiento final de la unión con Lituania.Este acuerdo transfirió Ucrania del Gran Ducado de Lituania a Polonia y transformó la política polaco-lituana en una unión real, preservándola más allá de la muerte de Segismundo II sin hijos, cuya participación activa hizo posible la finalización de este proceso.Livonia en el extremo noreste fue incorporada por Polonia en 1561 y Polonia entró en la Guerra de Livonia contra el Tsardom de Rusia .El movimiento ejecutor, que intentó controlar el dominio progresivo del estado por parte de las familias de magnates de Polonia y Lituania, alcanzó su punto máximo en el Sejm en Piotrków en 1562-1563.En el frente religioso, los Hermanos polacos se separaron de los calvinistas y la Biblia protestante de Brest se publicó en 1563. Los jesuitas, que llegaron en 1564, estaban destinados a tener un gran impacto en la historia de Polonia.