Τον 16ο αιώνα, τα κινήματα της Προτεσταντικής Μεταρρύθμισης έκαναν βαθιά εισβολή στον πολωνικό Χριστιανισμό και η μεταρρύθμιση που προέκυψε στην Πολωνία περιλάμβανε μια σειρά από διαφορετικά δόγματα.Οι πολιτικές θρησκευτικής ανεκτικότητας που αναπτύχθηκαν στην Πολωνία ήταν σχεδόν μοναδικές στην Ευρώπη εκείνη την εποχή και πολλοί που έφυγαν από περιοχές που σπαράσσονταν από θρησκευτικές διαμάχες βρήκαν καταφύγιο στην Πολωνία.Η βασιλεία του Βασιλιά Σιγισμούνδου Α' του Παλαιού (1506-1548) και του Βασιλιά Σιγισμούνδου Β' Αυγούστου (1548-1572) υπήρξε μάρτυρας μιας έντονης καλλιέργειας πολιτισμού και επιστήμης (μια Χρυσή Εποχή της Αναγέννησης στην Πολωνία), της οποίας ο αστρονόμος Νικόλαος Κοπέρνικος (1473). –1543) είναι ο πιο γνωστός εκπρόσωπος.Ο Jan Kochanowski (1530–1584) ήταν ποιητής και η κορυφαία καλλιτεχνική προσωπικότητα της περιόδου.Το 1525, κατά τη διάρκεια της βασιλείας του Σιγισμούνδου Α', το Τευτονικό Τάγμα εκκοσμικεύτηκε και ο Δούκας Αλβέρτος τέλεσε μια πράξη φόρου τιμής ενώπιον του Πολωνού βασιλιά (ο Πρωσικός φόρος τιμής) για το φέουδο του, το Δουκάτο της Πρωσίας.Η Μαζόβια τελικά ενσωματώθηκε πλήρως στο Πολωνικό Στέμμα το 1529.Η βασιλεία του Sigismund II έληξε την Jagiellonian περίοδο, αλλά οδήγησε στην Ένωση του Lublin (1569), μια τελική εκπλήρωση της ένωσης με τη Λιθουανία.Αυτή η συμφωνία μετέφερε την Ουκρανία από το Μεγάλο Δουκάτο της Λιθουανίας στην Πολωνία και μετέτρεψε την πολωνο-λιθουανική πολιτική σε μια πραγματική ένωση, διατηρώντας την πέρα ​​από τον θάνατο του άτεκνου Σιγισμούνδου Β', του οποίου η ενεργή συμμετοχή κατέστησε δυνατή την ολοκλήρωση αυτής της διαδικασίας.Η Λιβονία στα βορειοανατολικά ενσωματώθηκε από την Πολωνία το 1561 και η Πολωνία μπήκε στον Λιβονικό Πόλεμο κατά του Τσαρδισμού της Ρωσίας .Το κίνημα των εκτελεστών, το οποίο προσπάθησε να ελέγξει την προοδευτική κυριαρχία του κράτους από τις οικογένειες μεγιστάνων της Πολωνίας και της Λιθουανίας, κορυφώθηκε στο Sejm στο Piotrków το 1562–63.Στο θρησκευτικό μέτωπο, οι Πολωνοί Αδελφοί χώρισαν από τους Καλβινιστές και η Προτεσταντική Βίβλος της Βρέστης δημοσιεύτηκε το 1563. Οι Ιησουίτες, που έφτασαν το 1564, έμελλε να έχουν μεγάλη επίδραση στην ιστορία της Πολωνίας.