Im 16. Jahrhundert drangen protestantische Reformationsbewegungen tief in das polnische Christentum ein und die daraus resultierende Reformation in Polen umfasste eine Reihe verschiedener Konfessionen.Die in Polen entwickelte Politik der religiösen Toleranz war zu dieser Zeit in Europa nahezu einzigartig und viele, die aus von religiösen Konflikten zerrissenen Regionen flohen, fanden in Polen Zuflucht.Die Regierungszeit von König Sigismund I. dem Alten (1506–1548) und König Sigismund II. Augustus (1548–1572) war Zeuge einer intensiven Pflege von Kultur und Wissenschaft (ein goldenes Zeitalter der Renaissance in Polen), von der der Astronom Nikolaus Kopernikus (1473) berichtete –1543) ist der bekannteste Vertreter.Jan Kochanowski (1530–1584) war ein Dichter und die bedeutendste Künstlerpersönlichkeit seiner Zeit.Im Jahr 1525, während der Herrschaft von Sigismund I., wurde der Deutsche Orden säkularisiert und Herzog Albert vollzog vor dem polnischen König eine Huldigung (die preußische Huldigung) für sein Lehen, das Herzogtum Preußen.Masowien wurde schließlich 1529 vollständig in die polnische Krone eingegliedert.Die Herrschaft von Sigismund II. beendete die Jagiellonen-Zeit, führte jedoch zur Entstehung der Union von Lublin (1569), einer endgültigen Erfüllung der Union mit Litauen.Dieses Abkommen übertrug die Ukraine vom Großherzogtum Litauen an Polen und verwandelte das polnisch-litauische Gemeinwesen in eine echte Union, die über den Tod des kinderlosen Sigismund II. hinaus Bestand hatte, dessen aktive Beteiligung den Abschluss dieses Prozesses ermöglichte.Livland im äußersten Nordosten wurde 1561 von Polen eingemeindet und Polen trat in den Livländischen Krieg gegen das russische Zarentum ein.Die Hinrichtungsbewegung, die versuchte, die fortschreitende Herrschaft der Magnatenfamilien aus Polen und Litauen über den Staat einzudämmen, erreichte ihren Höhepunkt im Sejm in Piotrków in den Jahren 1562–63.An der religiösen Front trennten sich die Polnischen Brüder von den Calvinisten, und 1563 wurde die protestantische Brester Bibel veröffentlicht. Die Jesuiten, die 1564 eintrafen, sollten einen großen Einfluss auf die Geschichte Polens haben.