Efter 1547-49-krigen med Toungoo byggede Ayutthaya-kongen Maha Chakkraphat sin hovedstads forsvar op som forberedelse til en senere krig med burmeserne.Krigen 1547-49 endte med en siamesisk defensiv sejr og bevarede den siamesiske uafhængighed.Bayinnaungs territoriale ambitioner fik imidlertid Chakkraphat til at forberede sig på endnu en invasion.Disse forberedelser omfattede en folketælling, der forberedte alle dygtige mænd til at gå i krig.Våben og husdyr blev taget af regeringen som forberedelse til en storstilet krigsindsats, og syv hvide elefanter blev fanget af Chakkraphat for held og lykke.Nyheden om Ayutthayan-kongens forberedelse spredte sig hurtigt og nåede til sidst burmeserne.Det lykkedes Bayinnaung at indtage byen Chiang Mai i det nærliggende Lan Na-rige i 1556. Efterfølgende bestræbelser efterlod det meste af det nordlige Siam under burmesisk kontrol.Dette efterlod Chakkraphats rige i en usikker position, stillet over for fjendens territorium mod nord og vest.Bayinnaung krævede efterfølgende to af kong Chakkraphats hvide elefanter som hyldest til det stigende Toungoo-dynasti.Chakkraphat nægtede, hvilket førte til Burmas anden invasion af Ayutthaya-kongeriget.Bayinnaung-hærene marcherede ned til Ayutthaya.Der blev de holdt på afstand i ugevis af det siamesiske fort, hjulpet af tre portugisiske krigsskibe og artilleribatterier ved havnen.Angriberne erobrede endelig de portugisiske skibe og batterier den 7. februar 1564, hvorefter fortet prompte faldt.^[43] Med en nu 60.000 stærk styrke kombineret med Phitsanulok-hæren nåede Bayinnaung Ayutthayas bymur og bombarderede byen kraftigt.Selvom de var overlegne i styrke, var burmeserne ikke i stand til at erobre Ayutthaya, men krævede, at den siamesiske konge kom ud af byen under et flag af våbenhvile til fredsforhandlinger.Da han så, at hans borgere ikke kunne tage belejringen meget længere, forhandlede Chakkraphat fred, men til en høj pris.Til gengæld for den burmesiske hærs tilbagetog tog Bayinnaung prins Ramesuan (Chakkraphats søn), Phraya Chakri og Phraya Sunthorn Songkhram tilbage med sig til Burma som gidsel og fire siamesiske hvide elefanter.Mahathamraja, skønt en forræder, skulle efterlades som hersker over Phitsanulok og vicekonge over Siam.Ayutthaya-kongeriget blev en vasal af Toungoo-dynastiet, der skulle give tredive elefanter og tre hundrede sølvkatte til burmeserne hvert år.