På 1500-talet gjorde protestantiska reformationsrörelser djupa inbrytningar i den polska kristendomen och den resulterande reformationen i Polen involverade ett antal olika samfund.Politiken för religiös tolerans som utvecklades i Polen var nästan unik i Europa vid den tiden och många som flydde från regioner som slitits av religiösa stridigheter fann sin tillflykt till Polen.Kung Sigismund I den gamle (1506–1548) och kung Sigismund II Augustus (1548–1572) regeringstid bevittnade en intensiv odling av kultur och vetenskap (en guldålder av renässansen i Polen), varav astronomen Nicolaus Copernicus (1473) –1543) är den mest kända representanten.Jan Kochanowski (1530–1584) var en poet och periodens främsta konstnärliga personlighet.År 1525, under Sigismund I:s regeringstid, sekulariserades den tyska orden och hertig Albert utförde en hyllningsakt inför den polske kungen (den preussiska hyllningen) för hans len, hertigdömet Preussen.Mazovia införlivades slutligen helt i den polska kronan 1529.Sigismund II:s regeringstid avslutade den Jagiellonska perioden, men gav upphov till unionen av Lublin (1569), en ultimat uppfyllelse av unionen med Litauen.Detta avtal överförde Ukraina från Storhertigdömet Litauen till Polen och förvandlade den polsk-litauiska ordningen till en verklig union, och bevarade den bortom den barnlösa Sigismund II:s död, vars aktiva inblandning möjliggjorde fullbordandet av denna process.Livland längst i nordost införlivades av Polen 1561 och Polen gick in i det livländska kriget mot Rysslands tsardöme .Den exekutionistiska rörelsen, som försökte kontrollera den fortskridande dominansen av staten av magnatfamiljerna i Polen och Litauen, nådde sin topp vid Sejmen i Piotrków 1562–63.På den religiösa fronten splittrades de polska bröderna från kalvinisterna, och den protestantiska Brest-bibeln publicerades 1563. Jesuiterna, som anlände 1564, var avsedda att göra en stor inverkan på Polens historia.