På 1500-tallet gjorde protestantiske reformasjonsbevegelser dype inngrep i polsk kristendom, og den resulterende reformasjonen i Polen involverte en rekke forskjellige kirkesamfunn.Politikken for religiøs toleranse som utviklet seg i Polen var nesten unik i Europa på den tiden, og mange som flyktet fra regioner revet av religiøse stridigheter fant tilflukt i Polen.Kong Sigismund I den gamle (1506–1548) og kong Sigismund II Augustus (1548–1572) var vitne til en intens dyrking av kultur og vitenskap (en gullalder av renessansen i Polen), hvorav astronomen Nicolaus Copernicus (1473) –1543) er den mest kjente representanten.Jan Kochanowski (1530–1584) var en poet og periodens fremste kunstneriske personlighet.I 1525, under regjeringen til Sigismund I, ble den teutoniske orden sekularisert og hertug Albert utførte en hyllest for den polske kongen (den prøyssiske hyllest) for hans len, hertugdømmet Preussen.Mazovia ble til slutt fullstendig innlemmet i den polske kronen i 1529.Regjeringen til Sigismund II avsluttet den Jagiellonske perioden, men ga opphav til Union of Lublin (1569), en endelig oppfyllelse av unionen med Litauen.Denne avtalen overførte Ukraina fra Storhertugdømmet Litauen til Polen og forvandlet den polsk-litauiske politikken til en ekte union, og bevarte den utover døden til den barnløse Sigismund II, hvis aktive involvering gjorde fullføringen av denne prosessen mulig.Livonia helt i nordøst ble innlemmet av Polen i 1561 og Polen gikk inn i den livlandske krigen mot tsardømmet Russland .Eksekusjonistbevegelsen, som forsøkte å kontrollere den fremadskridende dominansen av staten av magnatfamiliene i Polen og Litauen, toppet seg ved Sejmen i Piotrków i 1562–63.På den religiøse fronten splittet de polske brødrene seg fra kalvinistene, og den protestantiske Brest-bibelen ble utgitt i 1563. Jesuittene, som ankom i 1564, var bestemt til å ha stor innvirkning på Polens historie.