Setelah perang tahun 1547–1549 dengan Toungoo, raja Ayutthaya Maha Chakkraphat membangun pertahanan ibu kotanya sebagai persiapan untuk perang berikutnya dengan Burma.Perang tahun 1547–1549 berakhir dengan kemenangan pertahanan Siam dan mempertahankan kemerdekaan Siam.Namun, ambisi teritorial Bayinnaung mendorong Chakkraphat bersiap untuk invasi lainnya.Persiapan ini termasuk sensus yang mempersiapkan semua orang yang mampu berperang.Senjata dan ternak diambil oleh pemerintah sebagai persiapan untuk upaya perang skala besar, dan tujuh ekor gajah putih ditangkap oleh Chakkraphat untuk keberuntungan.Berita tentang persiapan raja Ayutthayan menyebar dengan cepat, akhirnya sampai ke masyarakat Burma.Bayinnaung berhasil merebut kota Chiang Mai di dekat kerajaan Lan Na pada tahun 1556. Upaya selanjutnya membuat sebagian besar Siam utara berada di bawah kendali Burma.Hal ini membuat kerajaan Chakkraphat berada dalam posisi genting, berhadapan dengan wilayah musuh di utara dan barat.Bayinnaung kemudian meminta dua ekor gajah putih Raja Chakkraphat sebagai penghormatan kepada kebangkitan Dinasti Toungoo.Chakkraphat menolak, menyebabkan invasi kedua Burma ke Kerajaan Ayutthaya.Tentara Bayinnaung bergerak menuju Ayutthaya.Di sana, mereka ditahan selama berminggu-minggu oleh benteng Siam, dibantu oleh tiga kapal perang Portugis dan baterai artileri di pelabuhan.Para penjajah akhirnya merebut kapal dan baterai Portugis pada tanggal 7 Februari 1564, setelah itu benteng tersebut segera runtuh.^[43] Dengan kekuatan 60.000 orang yang digabungkan dengan tentara Phitsanulok, Bayinnaung mencapai tembok kota Ayutthaya, membombardir kota dengan gencar.Meski unggul dalam kekuatan, Burma tidak mampu merebut Ayutthaya, namun menuntut raja Siam keluar kota di bawah bendera gencatan senjata untuk perundingan perdamaian.Melihat bahwa warganya tidak dapat melakukan pengepungan lebih lama lagi, Chakkraphat menegosiasikan perdamaian, tetapi dengan harga yang mahal.Sebagai imbalan atas mundurnya tentara Burma, Bayinnaung membawa Pangeran Ramesuan (putra Chakkraphat), Phraya Chakri, dan Phraya Sunthorn Songkhram kembali bersamanya ke Burma sebagai sandera, dan empat ekor gajah putih siam.Mahathamraja, meskipun seorang pengkhianat, dibiarkan menjadi penguasa Phitsanulok dan raja muda Siam.Kerajaan Ayutthaya menjadi pengikut Dinasti Toungoo, diharuskan memberikan tiga puluh gajah dan tiga ratus kati perak kepada Burma setiap tahunnya.