Kasunod ng 1547–49 digmaan sa Toungoo, Ayutthaya haring Maha Chakkraphat binuo ang kanyang kabiserang depensa ng lungsod bilang paghahanda para sa susunod na digmaan sa Burmese.Ang digmaang 1547–49 ay nagwakas sa isang pagtatanggol na tagumpay ng Siamese at napanatili ang kalayaan ng Siamese.Gayunpaman, ang mga ambisyon ni Bayinnaung ay nagtulak kay Chakkraphat na maghanda para sa isa pang pagsalakay.Kasama sa mga paghahandang ito ang isang sensus na naghanda sa lahat ng may kakayahang pumunta sa digmaan.Ang mga armas at hayop ay kinuha ng gobyerno bilang paghahanda para sa isang malakihang pagsisikap sa digmaan, at pitong puting elepante ang nakuha ni Chakkraphat para sa suwerte.Mabilis na kumalat ang balita tungkol sa paghahanda ng haring Ayutthaya, na kalaunan ay nakarating sa Burmese.Nagtagumpay si Bayinnaung sa pagkuha ng lungsod ng Chiang Mai sa kalapit na kaharian ng Lan Na noong 1556. Ang mga sumunod na pagsisikap ay iniwan ang karamihan sa hilagang Siam sa ilalim ng kontrol ng Burmese.Iniwan nito ang kaharian ni Chakkraphat sa isang delikadong posisyon, na nahaharap sa teritoryo ng kaaway sa hilaga at kanluran.Kasunod na hiniling ni Bayinnaung ang dalawa sa mga puting elepante ni Haring Chakkraphat bilang pagkilala sa tumataas na Dinastiyang Toungoo.Tumanggi si Chakkraphat, na humantong sa ikalawang pagsalakay ng Burma sa Ayutthaya Kingdom.Ang mga hukbo ng Bayinnaung ay nagmartsa pababa sa Ayutthaya.Doon, itinago sila sa loob ng ilang linggo ng kuta ng Siamese, tinulungan ng tatlong barkong pandigma ng Portuges at mga bateryang artilerya sa daungan.Sa wakas ay nakuha ng mga mananakop ang mga barko at baterya ng Portuges noong 7 Pebrero 1564, pagkatapos ay agad na bumagsak ang kuta.^[43] Sa ngayon ay may 60,000 malakas na puwersa na pinagsama sa hukbong Phitsanulok, naabot ni Bayinnaung ang mga pader ng lungsod ng Ayutthaya, na mabigat na binomba ang lungsod.Bagama't nakahihigit sa lakas, hindi nakuha ng mga Burmese ang Ayutthaya, ngunit hiniling na ang hari ng Siamese ay lumabas sa lungsod sa ilalim ng bandila ng tigil-tigilan para sa negosasyong pangkapayapaan.Nang makitang hindi na makayanan ng kanyang mga mamamayan ang pagkubkob, nakipag-usap si Chakkraphat sa kapayapaan, ngunit sa mataas na presyo.Bilang kapalit ng pag-atras ng hukbong Burmese, dinala ni Bayinnaung si Prinsipe Ramesuan (anak ni Chakkraphat), Phraya Chakri, at Phraya Sunthorn Songkhram pabalik sa Burma bilang isang hostage, at apat na Siamese na puting elepante.Si Mahathamraja, bagama't isang taksil, ay iiwan bilang pinuno ng Phitsanulok at viceroy ng Siam.Ang Ayutthaya Kingdom ay naging basalyo ng Toungoo Dynasty, na kinakailangang magbigay ng tatlumpung elepante at tatlong daang catties ng pilak sa Burmese taun-taon.