Efter kriget med Toungoo 1547–49 byggde Ayutthaya-kungen Maha Chakkraphat upp sin huvudstads försvar som förberedelse för ett senare krig med burmeserna.Kriget 1547–49 slutade med en siamesisk försvarsseger och bevarade siamesisk självständighet.Bayinnaungs territoriella ambitioner fick dock Chakkraphat att förbereda sig för ytterligare en invasion.Dessa förberedelser inkluderade en folkräkning som förberedde alla dugliga män att gå ut i krig.Vapen och boskap togs av regeringen som förberedelse för en storskalig krigsinsats, och sju vita elefanter fångades av Chakkraphat för lycka.Nyheten om Ayutthayan-kungens förberedelser spred sig snabbt och nådde så småningom burmeserna.Bayinnaung lyckades ta staden Chiang Mai i det närliggande Lan Na-riket 1556. Efterföljande ansträngningar lämnade större delen av norra Siam under burmesisk kontroll.Detta lämnade Chakkraphats kungarike i en osäker position, inför fiendens territorium i norr och väster.Bayinnaung krävde därefter två av kung Chakkraphats vita elefanter som hyllning till den framväxande Toungoo-dynastin.Chakkraphat vägrade, vilket ledde till Burmas andra invasion av Ayutthaya-riket.Bayinnaung-arméerna marscherade ner till Ayutthaya.Där hölls de i schack i veckor av det siamesiska fortet, med hjälp av tre portugisiska krigsfartyg och artilleribatterier vid hamnen.Inkräktarna erövrade slutligen de portugisiska skeppen och batterierna den 7 februari 1564, varefter fortet omedelbart föll.^[43] Med en nu 60 000 stark styrka i kombination med Phitsanulok-armén nådde Bayinnaung Ayutthayas stadsmur och bombade staden kraftigt.Även om de var överlägsna i styrka kunde burmeserna inte ta Ayutthaya, utan krävde att den siamesiska kungen skulle komma ut ur staden under vapenvila för fredsförhandlingar.Chakkraphat såg att hans medborgare inte kunde ta belägringen mycket längre och förhandlade fram fred, men till ett högt pris.I utbyte mot den burmesiska arméns reträtt tog Bayinnaung med sig prins Ramesuan (Chakkraphats son), Phraya Chakri och Phraya Sunthorn Songkhram till Burma som gisslan och fyra siamesiska vita elefanter.Mahathamraja, även om han var en förrädare, skulle lämnas som härskare över Phitsanulok och vicekung över Siam.Ayutthayariket blev en vasall av Toungoo-dynastin, som krävdes för att ge trettio elefanter och trehundra katter silver till burmeserna varje år.