У 16. веку, протестантски реформаторски покрети дубоко су продрли у пољско хришћанство и резултирајућа реформација у Пољској укључивала је низ различитих деноминација.Политика верске толеранције која се развила у Пољској била је скоро јединствена у Европи у то време и многи који су побегли из региона растрзаних верским сукобима нашли су уточиште у Пољској.У време владавине краља Жигмунда И Старог (1506–1548) и краља Жигмунда ИИ Августа (1548–1572) дошло је до интензивног неговања културе и науке (златно доба ренесансе у Пољској), чији је астроном Никола Коперник (1473. –1543) је најпознатији представник.Јан Кохановски (1530–1584) је био песник и прва уметничка личност тог периода.Године 1525, за време владавине Сигисмунда И, Тевтонски ред је секуларизован и војвода Алберт је извршио чин омажа пред пољским краљем (пруски омаж) за његов феуд, Пруско војводство.Мазовија је коначно у потпуности укључена у пољску круну 1529.Владавина Сигисмунда ИИ окончала је период Јагелона, али је довела до Лублинске уније (1569), што је коначно испуњење уније са Литванијом.Овај споразум је пренео Украјину из Велике Кнежевине Литваније у Пољску и трансформисао пољско-литванску државу у стварну унију, очувајући је после смрти бездетног Сигисмунда ИИ, чије је активно учешће омогућило завршетак овог процеса.Ливонију на крајњем североистоку прикључила је Пољска 1561. године и Пољска је ушла у Ливонски рат против руског царства .Покрет егзекуциониста, који је покушавао да заустави напредујућу доминацију магнатских породица Пољске и Литваније над државом, достигао је врхунац на Сејму у Пјотркову 1562–63.На религиозном плану, пољска браћа су се одвојила од калвиниста, а протестантска брестачка Библија је објављена 1563. Језуитима, који су стигли 1564, било је суђено да имају велики утицај на историју Пољске.