
Durante o século 16, a Escócia passou por uma Reforma Protestante, transformando a igreja nacional em uma Kirk predominantemente calvinista com perspectiva presbiteriana, reduzindo significativamente os poderes dos bispos. No início do século, os ensinamentos de Martinho Lutero e João Calvino começaram a influenciar a Escócia, particularmente através de estudiosos escoceses que estudaram em universidades continentais. O pregador luterano Patrick Hamilton foi executado por heresia em St. Andrews em 1528. A execução de George Wishart, influenciado por Zwingli, em 1546, por ordem do cardeal Beaton, irritou ainda mais os protestantes. Os apoiadores de Wishart assassinaram Beaton logo depois e tomaram o Castelo de St. Andrews. O castelo foi mantido por um ano antes de ser derrotado com a ajuda francesa. Os sobreviventes, incluindo o capelão John Knox, foram condenados a servir como escravos nas galés em França, alimentando o ressentimento contra os franceses e criando mártires protestantes.
A tolerância limitada e a influência dos escoceses e protestantes exilados no exterior facilitaram a propagação do protestantismo na Escócia. Em 1557, um grupo de lairds, conhecidos como Senhores da Congregação, começou a representar politicamente os interesses protestantes. O colapso da aliança francesa e a intervenção inglesa em 1560 permitiram que um pequeno mas influente grupo de protestantes impusesse reformas à igreja escocesa. Naquele ano, o Parlamento adoptou uma confissão de fé que rejeitava a autoridade papal e a missa, enquanto a jovem Maria, Rainha da Escócia, ainda estava em França.
John Knox, que escapou das galés e estudou com Calvino em Genebra, emergiu como a figura principal da Reforma. Sob a influência de Knox, o Kirk reformado adotou um sistema presbiteriano e descartou muitas das elaboradas tradições da igreja medieval. O novo Kirk deu poder aos lairds locais, que muitas vezes controlavam as nomeações do clero. Embora a iconoclastia ocorresse amplamente, era geralmente ordenada. Apesar de uma população predominantemente católica, especialmente nas Terras Altas e nas Ilhas, os Kirk iniciaram um processo gradual de conversão e consolidação com relativamente pouca perseguição em comparação com outras Reformas Europeias.
As mulheres participaram ativamente do fervor religioso da época. O apelo igualitário e emocional do calvinismo atraiu homens e mulheres. O historiador Alasdair Raffe observa que homens e mulheres eram considerados igualmente propensos a estar entre os eleitos, promovendo relações estreitas e piedosas entre os géneros e dentro dos casamentos. As mulheres leigas ganharam novos papéis religiosos, particularmente nas sociedades de oração, marcando uma mudança significativa no seu envolvimento religioso e influência social.