Etter krigen 1547–49 med Toungoo bygde Ayutthaya-kongen Maha Chakkraphat opp hovedstadens forsvar som forberedelse til en senere krig med burmeserne.Krigen 1547–49 endte i en siamesisk defensiv seier og bevarte siamesisk uavhengighet.Bayinnaungs territorielle ambisjoner fikk imidlertid Chakkraphat til å forberede seg på en ny invasjon.Disse forberedelsene inkluderte en folketelling som forberedte alle dyktige menn til å gå i krig.Våpen og husdyr ble tatt av regjeringen som forberedelse til en storstilt krigsinnsats, og syv hvite elefanter ble tatt til fange av Chakkraphat for lykke.Nyheten om Ayutthayan-kongens forberedelse spredte seg raskt, og nådde til slutt burmeserne.Bayinnaung lyktes i å ta byen Chiang Mai i det nærliggende Lan Na-riket i 1556. Etterfølgende anstrengelser la det meste av det nordlige Siam under burmesisk kontroll.Dette etterlot Chakkraphats rike i en prekær posisjon, møtt med fiendtlig territorium i nord og vest.Bayinnaung krevde deretter to av kong Chakkraphats hvite elefanter som hyllest til det stigende Toungoo-dynastiet.Chakkraphat nektet, noe som førte til Burmas andre invasjon av Ayutthaya-riket.Bayinnaung-hærene marsjerte ned til Ayutthaya.Der ble de holdt i sjakk i flere uker av det siamesiske fortet, hjulpet av tre portugisiske krigsskip og artilleribatterier ved havnen.Inntrengerne fanget til slutt de portugisiske skipene og batteriene 7. februar 1564, hvoretter fortet umiddelbart falt.^[43] Med en nå 60 000 sterk styrke kombinert med Phitsanulok-hæren, nådde Bayinnaung Ayutthayas bymurer, og bombarderte byen kraftig.Selv om de var overlegne i styrke, klarte ikke burmeserne å fange Ayutthaya, men krevde at den siamesiske kongen skulle komme ut av byen under et flagg av våpenhvile for fredsforhandlinger.Da han så at innbyggerne hans ikke kunne ta beleiringen mye lenger, forhandlet Chakkraphat fred, men til en høy pris.I bytte mot at den burmesiske hæren trakk seg tilbake, tok Bayinnaung med seg prins Ramesuan (Chakkraphats sønn), Phraya Chakri og Phraya Sunthorn Songkhram tilbake til Burma som gissel, og fire siamesiske hvite elefanter.Selv om Mahathamraja var en forræder, skulle han stå igjen som hersker over Phitsanulok og visekonge av Siam.Ayutthaya-riket ble en vasal av Toungoo-dynastiet, pålagt å gi tretti elefanter og tre hundre katter sølv til burmeserne årlig.