Selepas perang 1547–49 dengan Toungoo, raja Ayutthaya Maha Chakkraphat membina pertahanan ibu kotanya sebagai persediaan untuk perang nanti dengan Burma.Perang 1547–49 berakhir dengan kemenangan pertahanan Siam dan mengekalkan kemerdekaan Siam.Bagaimanapun, cita-cita wilayah Bayinnaung mendorong Chakkraphat untuk bersiap sedia untuk satu lagi pencerobohan.Persediaan ini termasuk bancian yang menyediakan semua orang yang mampu untuk pergi berperang.Senjata dan ternakan telah diambil oleh kerajaan sebagai persediaan untuk usaha perang besar-besaran, dan tujuh ekor gajah putih telah ditangkap oleh Chakkraphat untuk nasib baik.Berita tentang persiapan raja Ayutthaya tersebar dengan cepat, akhirnya sampai ke Burma.Bayinnaung berjaya menawan bandar Chiang Mai dalam kerajaan Lan Na yang berdekatan pada tahun 1556. Usaha seterusnya menyebabkan sebahagian besar utara Siam di bawah kawalan Burma.Ini menyebabkan kerajaan Chakkraphat berada dalam keadaan tidak menentu, berhadapan dengan wilayah musuh di utara dan barat.Bayinnaung kemudiannya menuntut dua ekor gajah putih Raja Chakkraphat sebagai penghormatan kepada Dinasti Toungoo yang semakin meningkat.Chakkraphat menolak, membawa kepada pencerobohan kedua Burma ke atas Kerajaan Ayutthaya.Tentera Bayinnaung berarak turun ke Ayutthaya.Di sana, mereka ditahan selama berminggu-minggu oleh kubu Siam, dibantu oleh tiga kapal perang Portugis dan bateri artileri di pelabuhan.Penceroboh akhirnya menawan kapal dan bateri Portugis pada 7 Februari 1564, selepas itu kubu itu segera runtuh.^[43] Dengan kini 60,000 pasukan yang kuat digabungkan dengan tentera Phitsanulok, Bayinnaung mencapai tembok kota Ayutthaya, mengebom hebat bandar itu.Walaupun lebih hebat dari segi kekuatan, orang Burma tidak dapat menawan Ayutthaya, tetapi menuntut supaya raja Siam keluar dari bandar di bawah bendera gencatan senjata untuk rundingan damai.Melihat bahawa rakyatnya tidak dapat bertahan lebih lama lagi, Chakkraphat berunding damai, tetapi dengan harga yang tinggi.Sebagai pertukaran untuk pengunduran tentera Burma, Bayinnaung membawa Putera Ramesuan (anak Chakkraphat), Phraya Chakri, dan Phraya Sunthorn Songkhram kembali bersamanya ke Burma sebagai tebusan, dan empat ekor gajah putih Siam.Mahathamraja, walaupun pengkhianat, harus ditinggalkan sebagai pemerintah Phitsanulok dan raja muda Siam.Kerajaan Ayutthaya menjadi vasal Dinasti Toungoo, dikehendaki memberikan tiga puluh ekor gajah dan tiga ratus kati perak kepada orang Burma setiap tahun.