Pada tahun 1965, menghadapi ketegangan yang semakin memuncak dan untuk mengelakkan konflik selanjutnya, Perdana Menteri Malaysia Tunku Abdul Rahman mencadangkan pengusiran Singapura dari Malaysia .Syor ini kemudiannya telah diluluskan oleh Parlimen Malaysia pada 9 Ogos 1965, dengan undian sebulat suara menyokong pemisahan Singapura.Pada hari yang sama, Lee Kuan Yew yang penuh emosi, Perdana Menteri Singapura, mengumumkan kemerdekaan baru negara kota itu.Bertentangan dengan kepercayaan popular bahawa Singapura diusir secara unilateral, dokumen baru-baru ini mendedahkan bahawa perbincangan antara Parti Tindakan Rakyat (PAP) Singapura dan Perikatan Malaysia telah berlangsung sejak Julai 1964. Lee Kuan Yew dan Goh Keng Swee, seorang pemimpin kanan PAP, mendalangi perpisahan dengan cara yang memperlihatkannya sebagai keputusan yang tidak boleh ditarik balik kepada orang ramai, bertujuan untuk memanfaatkan kedua-dua politik dan ekonomi.^[16]Berikutan pemisahan itu, Singapura menjalani pindaan perlembagaan yang memindahkan negara kota itu kepada Republik Singapura.Yusof Ishak, sebelum ini Yang di-Pertuan Negara atau wakil naib raja, ditabalkan sebagai Presiden pertama Singapura.Walaupun dolar Malaya dan Borneo British berterusan sebagai mata wang undang-undang untuk tempoh yang singkat, perbincangan mengenai mata wang yang dikongsi antara Singapura dan Malaysia telah diadakan sebelum akhirnya pengenalan dolar Singapura pada tahun 1967. ^[17] Di Malaysia, kerusi parlimen yang sebelum ini dipegang. oleh Singapura telah diperuntukkan semula ke Tanah Melayu, yang mengubah keseimbangan kuasa dan pengaruh yang dipegang oleh negeri Sabah dan Sarawak.Keputusan untuk memisahkan Singapura daripada Malaysia mendapat reaksi keras, khususnya daripada pemimpin di Sabah dan Sarawak.Pemimpin-pemimpin ini melahirkan perasaan pengkhianatan dan kekecewaan kerana tidak dirujuk semasa proses pemisahan. Ketua Menteri Sabah, Fuad Stephens, menyatakan kesedihan yang mendalam dalam surat kepada Lee Kuan Yew, manakala pemimpin seperti Ong Kee Hui dari Parti Rakyat Bersatu Sarawak mempersoalkan rasional kewujudan Malaysia selepas pemisahan.Di sebalik kebimbangan ini, Timbalan Perdana Menteri Malaysia Abdul Razak Hussein mempertahankan keputusan itu, mengaitkan kerahsiaan dan kesegeraan langkah itu kepada Konfrontasi Indonesia–Malaysia yang sedang berlangsung.^[18]